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。2019年3月5日；26（10）：2566-2579.e.10。
doi:10.1016/j.celrep.2019.02.016。

人多能干细胞衍生的间皮世系多能干血管祖细胞在组织工程和修复中的应用

托马斯·科伦加 1, 米兰达·海沃思 1, 塞巴斯蒂安·克雷 2, 大卫·M·雷诺兹 1, 罗曼·陈 1, 克里斯托弗·L·纳佐 三, 约翰内斯·鲍尔 4, 阿马尔·辛格 1, 珍妮·弗洛林 三, 马可·梅茨格 5, 多尔顿 6
附属机构

人多能干细胞衍生的间皮世系多能干血管祖细胞在组织工程和修复中的应用

托马斯·科伦加等。 单元格代表。 。

摘要

在本报告中，我们描述了间皮谱系的人类多能干细胞衍生血管祖细胞（MesoT）。MesoT细胞是多能细胞，可产生平滑肌细胞、内皮细胞和周细胞，并在体外自我组装成血管样网络。将MesoT细胞移植到机械损伤的新生小鼠心脏中，迁移到损伤组织中，并在修复区形成新生的冠状动脉。当接种到脱细胞的血管支架上时，MesoT细胞分化为主要的血管谱系，并自组装成能够支持移植后外周血流量的血管系统。这些发现证明了MesoT细胞的体内功能和在血管工程应用中的潜在用途。

关键词：间皮；再生医学；干细胞；组织工程；血管祖细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益申报

本报告（D.M.R.和S.D.）中所述的知识产权已经授予或正在申请专利。

数字

图1。
图1..hPSC衍生的MesoT显示初级间皮的分子特征
（A） 用于RNA-seq分析的细胞来源。将从小鼠胚胎肠道、肝脏、心脏和肺部（胚胎第15.5天[E15.5]）分离的hPSC衍生的间皮T细胞和tdTomato+间皮与公共领域的RNA-seq数据进行比较。（B） 向SplM（ISL1）中添加Wnt3a、BMP4和维甲酸（RA）+，NKX2.5+、ZO1+)有效生成MesoT（WT1+，αSMA+、VIM+)具有间充质表型。比例尺，50μm。（C） qRT-PCR数据显示SplM标记转录水平的折叠变化(ISL1、NKX2.5、，和GATA4协议)和MesoT(WT1，TBX18，和TCF21型)人类胚胎干细胞定向分化后（hESCs，WA09）。用18S RNA归一化后，对每个转录物进行技术性TaqMan分析，一式三份，显示相对于未经处理的hESCs（WA09）的折叠变化。（D）左：根据小鼠和人类直系图对所有人类（黑盒）和小鼠（红盒）RNA-seq样本进行层次聚类（欧几里德距离，完全连锁）。聚类前，对这两个物种的数据进行对数转换并缩放至平均值=0和标准偏差=1。右：阵列树树状图突出显示部分的放大部分（左），显示hPSC衍生的MesoT细胞与人类（h）和成人（a）心外膜（m，小鼠间皮；f，胎儿间皮）密切相关。指出了独立实验中的重复数字。误差线±标准偏差。另请参见图S1和S2以及表S4。
图2。
图2.MesoT的表观遗传学和转录谱与血管细胞类型相似
（A） 根据包含DNA甲基化谱的模块9的1846个胞嘧啶的β值，对人类组织和hESC衍生的样品进行分层聚类（欧几里得距离，完全连锁）。阵列树树状图和这些胞嘧啶的β值分布以热图形式（顶部）和方框和胡须图（底部）表示。（B） 卡通描绘了介体T细胞向血管命运过渡时启动和激活增强子的表观遗传景观。顶部描述了在增强子位点组蛋白H3上存在K4me1时，MesoT中的血管基因“启动”。底部描述了血管基因的启动增强子，当它们分化为平滑肌细胞（SMC）或内皮细胞（EC）时，通过添加K27ac被激活。（C） （D）中数据的增强器和基因本体发现管道（图S3B–S3D）。（D） 与MesoT细胞相比，与初级平滑肌和内皮细胞上调基因相关的增强子的H3K4me1（红色）和H3K27ac（蓝色）ChIP-seq数据的热图。（E） 对hESC衍生间皮细胞（间皮细胞和MLC）、初级胎儿组织（肝脏、心脏、大脑、脊髓和后脑）和初级细胞（内皮细胞和SMC）中高表达的前50%基因进行主成分分析。MesoT和MesoT（FCS）（自我更新）细胞与血管细胞类型（内皮和SMC）和人胚胎干细胞衍生间皮（MLC）紧密聚集。另请参见图S3以及表S1和S4。
图3。
图3 MesoT细胞有效分化为平滑肌和内皮细胞
（A） 在CDM（–Activin A）中用PDGF-BB（50 ng/ml）处理MesoT细胞12天，用α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、钙调素和肌球蛋白重链11（MYH11）抗体进行检测。比例尺，100μm（左）和50μm（右）。（B） 在补充PDGF-BB或VEGF-A的CDM（–A）中生长的MesoT细胞165根据SMC和EC的谱系特异性标记的表达对SB431542进行量化。所有生物实验一式三份。（C） 如（A）所示，用100μM卡巴胆碱或50 mM KCl处理3,3'-二十八烷氧基碳菁（DiO）标记的SMC，以刺激功能性收缩。比例尺，200μm。（D） 治疗后测量SMC表面积（C）。收缩以单个细胞的细胞表面积变化百分比表示。将每个治疗组与相应的对照时间点进行比较，以确定统计学意义。b=20。用CDM（–A）、VEGF-A处理的（E和F）MesoT细胞165用CD31、vWF和DAPI（E）抗体对SB431542进行固定和检测，或用VE-卡德林（蓝色）或同型对照（红色）进行流式细胞术分析。比例尺，50μm。（G）变速箱-在添加VEGF-A的CDM（–A）中培养MesoT细胞后，测量内皮电阻（TEER）16514、21和28天后，单独使用（+VEGF）或与SB431542（+VEGF+SB），并与原发性皮肤微血管内皮细胞（1°EC）进行比较。n=3。（H） 通过测量FITC-右旋糖酐（40 kDa）从心尖侧到基底侧的灌注来测试屏障完整性。控件表示缺少单元格。当将细胞与1°EC进行比较时，未确定统计显著性。（一） （G）和（H）中使用的生物反应器培养系统示意图。（J） 细胞单层的免疫荧光如（I）所示，显示紧密连接标记ZO1（顶部）和H&E染色（底部）的表达。比例尺，100μm。（K） MesoT衍生内皮的透射电镜图像。红色箭头表示紧密的细胞连接。插图（顶部）显示在底部。比例尺分别为500 nm和200 nm**双向方差分析的p=0.0027****单尾t检验p<0.0001。误差线±SEM。另请参见图S4。
图4。
图4 MesoT细胞是多功能血管祖细胞
（A） MesoT（FBS）细胞的群体倍增。时间=0是细胞首次进入含血清培养基的时间。应用于数据的简单线性回归分析（蓝色虚线）显示了一条具有决定系数（R2)=0.9774，斜率为0.8282+/-0.0563。实验n=3，一式三份。（B） 使用Life Technologies Click-iT Plus EdU Alexa Fluor流式细胞术检测试剂盒对第4代和第9代（p4和p9）的自我更新的MesoT（FBS）细胞进行细胞周期分析。p4的n=4，p9的n=3，全部一式三份。（C和D）每个通道的代表性二维流图，显示门控策略，以确定（B）每个细胞周期阶段的细胞百分比。（E） 用于确定自我更新MesoT（FBS）多潜能的克隆分析策略。（F） 荧光激活细胞分选（FACS）门控策略，获得用于克隆分析的单个细胞。三重阳性单细胞（CD44+/CD73型+/CD105型+)将其分选到96倍的平板上进行扩增和下游谱系分析。青色为同型对照。（G） 扩增后，选择14个克隆进行下游谱系分析。分别用2%FBS+VEGF或+PDGF-BB处理MesoT（FBS）细胞以分化内皮细胞或平滑肌细胞。细胞被固定，并用抗vWF（内皮）或MYH11（SMC）抗体进行检测。>使用ImageJ对每个克隆的3个独立图像中的45个细胞进行量化，以确定产生每个谱系的细胞百分比。（H） 用VEGF处理的CDM（–Activin A）中的MesoT产生EC混合物（vWF+)和SMC（钙调素+). 比例尺，50μm。（I和J）细胞（如（H））在基质上培养12天。用αSMA和vWF抗体探测得到的血管结构的亮场图像（I），用DAPI（J）对细胞核进行反染色。比例尺，50μm。误差线±SEM。另请参见图S4。
图5。
图5新生小鼠心脏损伤模型中MesoT细胞并入新形成的血管
（A） 对P0.5幼鼠进行手术，包括心室顶点切除。（B） 切除后，用1×10的2μL混悬液覆盖受损心脏6DiO标记的MesoT细胞，然后缝合胸腔和胸壁。微米棒，1 mm（C）冷冻切片（10μm），用于损伤后30天修复的小鼠心脏。用αSMA、CD31、人高尔基体抗原和DAPI的抗体探测组织。比例尺，50μm。（D） 显示由人类μSMA组成的亚低温血管（bv）的修复区+细胞和人CD31+细胞。比例尺：左上，20μm；其他面板，10μm。（E） （E）所示面板的放大图像显示人类内皮细胞和平滑肌细胞并入新生血管。比例尺，10μm。另请参见图S5。
图6。
图6.脱细胞生物支架与MesoT血管祖细胞的再融合在移植时重新填充血管网络并形成功能性投资血管在体内
（A-C）去细胞大鼠空肠（A）注射酚红以对比细胞灌注前的血管系统的图像（B和C）。（D） 用（+VEGF）培养基通过动脉和静脉插管灌注MesoT细胞。MTT分析成像显示28天后新生血管与代谢活性细胞的关系。右边是左边插图的放大图。红线表示各种尺寸的代表性容器。用人核抗原（hNA）和DAPI对接种MesoT细胞获得的血管进行染色。（F–H）使用CD31或αSMA抗体对（D）中直径较小（F）、中等（G）和较大（H）的血管进行染色。比例尺，100μm。（一） 通过FITC-右旋糖酐灌注进行血管屏障完整性测试。左：灌注前的亮场图像。中间：重复灌注和清洗血管网后FITC-右旋糖酐残留的活体显微镜图像。右：乙酰化低密度脂蛋白（LDL，红色）的摄取。NucBlue Live ReadyProbes对Nuclei进行可视化。比例尺，100μm。（J） 用CD31抗体固定和染色后的血管网薄片显微镜图像。比例尺，400μm。（K） 将重新种植的血管构建物移植到8周龄免疫缺陷雌性大鼠体内，并与宿主循环系统吻合（白色箭头）。（五十） 收获后移植移植物的大体解剖图像，显示宿主含氧血液的存在以及无阻塞或渗漏。（M–O）收获的移植物用CD31（红色）和αSMA（绿色）抗体染色。图中显示了小（M）、中（N）和（O）大血管。比例尺，100μm。另请参见图S6和视频S1和S2。
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