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.2019年5月；54(5):1676-1690.
doi:10.3892/ijo.2019.4726。 Epub 2019年2月27日。

赖氨酰氧化酶样2沉默通过Src/FAK信号通路抑制肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化

希宏（Xi Hong） 1, 余建军 1
附属公司

赖氨酰氧化酶样2沉默通过Src/FAK信号通路抑制肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化

希宏（Xi Hong）等。 国际癌症杂志. 2019年5月.

摘要

本研究的目的是通过类固醇受体辅活化子（Src）/黏着斑激酶（FAK）信号通路研究赖氨酰氧化酶样2（LOXL2）对肾癌（RCC）细胞侵袭、迁移和上皮-间充质转化（EMT）的影响。收集80例肾细胞癌患者的肾细胞癌组织和邻近正常组织。采用免疫组织化学方法测定LOXL2蛋白的阳性表达率。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）检测LOXL2在HK‑2、786‑O、ACHN、Caki1和A498细胞系中的表达水平。选择LOXL2高表达的786‑O细胞进行基因沉默实验，而LOXL2低表达的Caki1细胞用于过表达实验。RT-qPCR和western blot分析检测LOXL2、FAK、Src、基质金属蛋白酶（MMP）‑9、上皮（E）‑钙粘蛋白、神经元（N）‑钙粘蛋白和波形蛋白的表达。采用MTT法、Transwell法、创伤愈合法和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期分布和凋亡。RCC组织中LOXL2的蛋白表达率高于邻近正常组织。与邻近正常组织相比，RCC组织中LOXL2、FAK、Src、MMP‑9、N‑钙粘蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平以及FAK和Src磷酸化水平升高，而E‑钙黏蛋白的mRNA和蛋白表达降低。用小干扰（si）RNA转染抗LOXL2的786‑O细胞后，si‑LOXL2和PP2抑制剂处理组中FAK、Src、MMP‑9、N‑钙粘蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平以及磷酸化FAK和Src的水平显著降低，而E‑钙粘蛋白的含量显著增加。此外，细胞增殖、侵袭、迁移和G1期RCC细胞百分比降低，细胞凋亡增加。此外，转染LOXL2的Caki1细胞表现出相反的趋势。总之，这些结果表明，LOXL2沉默通过抑制Src/FAK信号通路抑制RCC细胞的侵袭、迁移和EMT。

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数字

图1
图1
苏木精和伊红染色。与正常邻近组织相比，肾癌组织中的细胞表现出去分化形态和无序排列（放大倍率，×200；bar，50µm） ●●●●。
图2
图2
免疫组化结果显示，LOXL2蛋白在RCC细胞中高表达。（A） LOXL2阳性细胞位于细胞质中，如棕黄色颗粒所示（放大倍数×200）。（B） LOXL2在RCC组织中的蛋白表达率为72.5%（58/80），在邻近正常组织中的表达率为17.5%（14/80）；n=80。Aχ2试验用于分析。*与邻近正常组织相比，P<0.05。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；肾细胞癌。
图3
图3
根据逆转录定量聚合酶链反应和western blot分析，LOXL2和FAK/Src信号通路相关基因在RCC组织中高度表达，与上皮-间充质转化相关的基因受到影响。（A） 与邻近正常组织相比，RCC组织中LOXL2、FAK、Src、MMP-9、N-cadherin和vimentin的mRNA表达增加，而E-cadherin的表达降低。（B） 与邻近正常组织相比，肾细胞癌组织中LOXL2、FAK、Src、MMP-9、N-钙粘蛋白和波形蛋白的蛋白表达增加，而E-钙粘蛋白的蛋白表达减少；n=80。（C） 定量表达LOXL2、FAK、P-FAK、Src、P-Src和MMP-9、E-钙粘蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白。采用配对t检验进行分析；*与邻近正常组织相比，P<0.05。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；类固醇受体辅激活剂；粘着斑激酶；肾细胞癌；基质金属蛋白酶；P-，磷酸化；N-钙粘蛋白，神经元钙粘蛋白；E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白。
图4
图4
筛选结果确保选择786-O细胞进行siRNA实验，选择Caki1细胞进行过表达实验。（A） 与所有其他肾癌细胞系相比，LOXL2的mRNA表达在786-O细胞中最高，在Caki1细胞中最低。*与HK-2细胞相比，P<0.05。（B） LOXL2 mRNA表达降低（以siRNA-NC组为对照组）。*与siRNA-NC组相比，P<0.05。（C） 用siRNA质粒转染后786-O细胞的蛋白带图像。*与siRNA-NC组相比P<0.05；#与siRNA-LOXL2-1组相比P<0.05；$与siRNA-LOXL2-2组相比，P<0.05。（D） LOXL2 mRNA表达增加（空白组作为对照组）。*与空白组相比，P<0.05。（E） LOXL2过表达质粒转染Caki1细胞后的蛋白带图像。采用单因素方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照；小干扰RNA。
图5
图5
腺病毒载体成功转染（放大倍数×100）。（A） 在光学显微镜下观察RCC细胞总数。（B） 在si-NC、si-LOXL2、空载体和LOXL2载体组的细胞中观察到大量绿色荧光。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照。
图6
图6
LOXL2沉默抑制FAK/Src通路的激活以及与上皮-间充质转化相关的影响因素。（A） 一旦用si-LOXL2转染786-O细胞，FAK、Src、MMP-9、N-cadherin和vimentin的mRNA表达显著降低，E-cadherin的mRNA表达显著增加；*与空白组和si-NC组相比，P＜0.05。（B） 一旦用LOXL2载体转染Caki1细胞，FAK、Src、MMP-9、N-cadherin和vimentin的mRNA表达显著增加，E-cadherin的mRNA表达显著降低。在PP2组中，mRNA表达变化呈现相反的趋势*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。（C） 一旦用si-LOXL2转染786-O细胞，FAK、Src、MMP-9、N-cadherin和vimentin的蛋白表达显著降低，E-cadherin的蛋白表示显著增加。*与空白组和si-NC组相比，P＜0.05。（D） 一旦用LOXL2载体转染Caki1细胞，FAK、Src、MMP-9、N-cadherin和vimentin的蛋白表达显著增加，E-cadherin的蛋白表示显著降低。在PP2组中，蛋白质表达变化呈现相反的趋势。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。采用单因素方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；类固醇受体辅激活剂；FAK，粘着斑激酶；基质金属蛋白酶；NC，阴性对照；P-，磷酸化；si-，小干扰RNA；N-钙粘蛋白，神经元钙粘蛋白；E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白。
图7
图7
根据MTT分析，LOXL2沉默可抑制肾癌细胞的增殖。（A） 786-O细胞转染后的细胞增殖曲线。*与空白组和si-NC组相比，P<0.05。（B） Caki1细胞转染后的细胞增殖曲线。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。采用单因素方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照；si-，小干扰RNA；外径，光密度。
图8
图8
根据Transwell分析的数据，沉默LOXL2可能抑制肾癌细胞的侵袭。（A） 侵入基底外侧室的786-O细胞数量显著减少。（B） 侵入细胞的数量。*与空白组和si-NC组相比，P＜0.05。（C） 侵入基底外侧室的Caki1细胞数量显著增加。（D） 侵入细胞的数量。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。采用单向方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照；si-，小干扰RNA。
图9
图9
根据划痕试验，沉默LOXL2可能抑制肾癌细胞的迁移。（A） 一旦用si-LOXL2转染786-O细胞，迁移细胞的数量就减少了。（B） 量化细胞迁移距离。*与空白组和si-NC组相比，P<0.05。（C） 用LOXL2载体转染Caki1细胞后，迁移细胞的数量增加。（D） 量化细胞迁移距离。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。采用单因素方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照；si-，小干扰RNA。
图10
图10
流式细胞术显示，LOXL2沉默后，肾癌细胞周期分布受到抑制，细胞凋亡得到促进。（A） 一旦用si-LOXL2转染786-O细胞，S期细胞数量显著减少。（B） 量化细胞周期每个阶段的细胞数量。*与空白组和si-NC组相比，P<0.05。（C） 用LOXL2载体转染Caki1细胞后，S期细胞数量显著增加。（D） 量化细胞周期每个阶段的细胞数量。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。（E） 用si-LOXL2转染786-O细胞后，细胞凋亡显著增强。（F） 量化的凋亡率。*与空白组和si-NC组相比，P<0.05。（G） 用LOXL2载体转染Caki1细胞后，Caki1凋亡显著降低。（H） 量化的凋亡率。*与空白载体组和空白载体组相比，P<0.05；#与LOXL2载体组相比，P<0.05。采用单向方差分析进行比较，实验重复三次。LOXL2，赖氨酰氧化酶样2；NC，阴性对照；si-，小干扰RNA。
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