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。2019年1月14:9:3157。
doi:10.3389/fimmu.2018.03157。 2018年eCollection。

PDL1融合蛋白通过抑制过度反应CD8保护实验性脑疟疾+T细胞反应

王军（Jun Wang） 1 2, 岳丽 1, 严慎 1, 焦亮 1, 李英辉 1, 黄玉霄 1, 刘雪武 1, 江东波 2, 杨淑娅（Shuya Yang） 2, 亚昭 1, Kun Yang（昆阳） 2
附属机构

PDL1融合蛋白通过抑制过度反应CD8保护实验性脑疟疾+T细胞反应

王军（Jun Wang）等。 前部免疫。 。

摘要

脑疟疾（CM），主要由恶性疟原虫(P.f公司），是严重疟疾最致命的并发症之一。作为脑过滤CD8介导的免疫病理学+T细胞是CM的主要发病机制，临床上没有安全有效的治疗方法，主要集中在CD8+T细胞。需要新的方法来保护宿主免受伤害。有证据表明，程序性死亡-1（PD-1）是最有效的免疫调节分子之一，我们构建了两种可溶性融合蛋白PDL1-IgG1Fc和PDL2-IgG1Flc，以增强先天性和适应性免疫细胞（包括巨噬细胞和CD8）的PD-1/PDL信号通路+T细胞。首先，我们确认PD-1信号通路缺陷导致CD8水平升高+PD-1缺陷患者T细胞增殖和生存时间缩短(预测值1-/-)小鼠比WT小鼠。其次，PDL1-IgG1Fc治疗组小鼠的生存时间比对照组延长。此外，观察到PDL1-IgG1Fc通过限制过反应性CD8改善血脑屏障（BBB）破坏+实验性脑疟疾（ECM）期间的T细胞毒性。进一步研究发现，PDL1-IgG1Fc处理的巨噬细胞在巨噬细胞M1极化及其对CD8抗原提呈能力方面表现出显著抑制+T细胞。总之，我们的结果表明，在ECM发病前的早期给予PDL1-IgG1Fc对维持脑内免疫微环境的稳态具有明显的作用，被认为是未来对抗CM的一个有希望的候选药物。

关键词：CD8+T细胞；PD-1/PDL1；实验性脑疟疾；免疫治疗；巨噬细胞。

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数字

图1
图1
PD-1信号通路参与ECM的发育。C57BL/6雄性小鼠和预测值1−/−用1×10感染C57BL/6雄性小鼠（6～8周龄）7pRBC。每日监测存活率（A）。预测值1−/−小鼠表现出加重的ECM症状，其生存时间短于WT小鼠（log-rank试验，n个= 10,P（P）= 0.0046). 脾脏CD8+从感染者身上分离出T细胞预测值1−/−和WT小鼠5 dpi，在CFSE染色后与亚最佳浓度的抗CD3和抗CD28单克隆抗体（0.03μg/ml）共同孵育。培养4天后。流式细胞术结果（B），已划分索引（C）和分裂细胞百分比（C）Flowjo软件分析显示CD8具有较高的增殖能力+T细胞在预测值1−/−小鼠比WT小鼠。CCK-8使用的增殖试验显示了相同的结果（E）。（F）qPCR显示，在IFN-γ和pRBC刺激的原代BMEC中PDL1和ICAM-1的表达水平显著增加。（G）脾脏PD-1比率+CD8（CD8）+T细胞占总CD8+每天监测ECM小鼠的T细胞。结果来自三个独立的实验。数据来自三个独立的实验。*表示差异显著（未配对t吨-测试，n个= 10, 0.01 <P（P）< 0.05).
图2
图2
活化的CD8+T细胞在ECM期间杀死BMEC。（A）用IFN-γ刺激BMEC，并与pRBC或不与pRBCs共同孵育24 h，然后CD8+添加来自幼年小鼠或感染PbA7dpi小鼠的T细胞。24小时后拍摄BMEC。（B）在不同的E:T比率下用活化/原始CD8培养BMEC+T细胞。收集细胞培养上清液进行LDH释放细胞毒性试验。结果来自三个独立的实验。*表示差异显著（未配对t吨-测试，0.01<P（P）< 0.05).
图3
图3
PDL1-IgG1F治疗可保护小鼠免受ECM的伤害。用PbA感染C57BL/6小鼠，并在第0天静脉注射PDL1-IgG1Fc/PDL2-IgG1Fc（0.1mg/只小鼠）或IgG1Fc（0.05mg/只小鼠）。生存曲线（A）（对数库测试，n个= 10,P（P）=0.001），血液寄生虫病（B）.体重变化（C），脾肿大（D、E）、H&E染色脑切片（F）、血清IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β浓度（G）7dpi时，PDL1-IgG1Fc治疗可保护小鼠免受ECM的影响。数据来自至少三个独立实验。*和**表明差异显著（未配对t吨-测试，n个= 10, 0.01 <P（P）<0.05和0.001<P（P）分别<0.01）。
图4
图4
PDL1-IgG1Fc可减少ECM造成的BBB损坏。（A）PDL1/PDL2-IgG1Fc治疗小鼠的代表性大脑以7 dpi的速度静脉注射100μl 1%EB。（B）EB的分光光度定量。（C）EB荧光显示PDL1-IgG1Fc治疗小鼠的BBB损伤较小（绿色：CD31，红色：EB荧光，蓝色：细胞核）。（D）脑含水量定量显示PDL1-IgG1Fc保护小鼠免受血管渗漏。结果来自三个独立的实验。*和**表明差异显著（未配对t吨-测试，n个= 10, 0.01 <P（P）<0.05和0.001<P（P）分别<0.01）。
图5
图5
PDL1-IgG1Fc通过限制过度反应CD8对BMEC的靶向杀伤来改善BBB中断+T细胞。脾脏CD8+从不同处理组分离T细胞，然后在CFSE染色后与亚最佳浓度的抗CD3和抗CD28单克隆抗体（0.03μg/ml）共同培养。培养4天后，CD8+收集T细胞并通过流式细胞术检测其增殖。流式细胞术结果（A），分指数（Div.index）（B）和被分割单元格的百分比（%被分割）（C）Flowjo软件分析显示PDL1-IgG1Fc减弱了CD8的增殖能力+T细胞。安在体外构建BBB模型，FITC-BSA通过Bend单层细胞的数量。检测到3个细胞进入下腔作为BBB模型通透性的标志，下腔FITC-BSA的数量表明脾CD8的细胞毒性+PDL1-IgG1Fc治疗小鼠的BBB T细胞减少（D）分离原代BMEC，并与pRBC、IFN-γ和脾/脑要求的CD8共同培养+来自不同组小鼠的T。脾脏CD8+通过LDH释放试验分析T细胞的细胞毒性（E）.脾CD8分泌的颗粒酶B+T细胞（F）和需要大脑的CD8+T细胞（G）通过ELISA测定。结果来自三个独立的实验。*和**表明差异显著（未配对t吨-测试，0.01<P（P）<0.05和0.001<P（P）分别<0.01）。
图6
图6
PDL1-IgG1Fc对PbA感染早期巨噬细胞分泌细胞因子的影响。C57BL/6雄性小鼠（6周龄）分为四组：对照组(n个=15），巴基斯坦(n个=14），PbANKA+PDL1-IgG1Fc(n个=12）和PbANKA+IgG1Fc(n个= 15). 所有小鼠在4 dpi时被斩首。（A）用MILLIPLEX MAP试剂盒检测这些小鼠的血清IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、MIG和TNF-α水平。（B）通过差异粘附方法分离小鼠的脾脏巨噬细胞。脾巨噬细胞分别植入6孔细胞培养簇中。24小时后，用MILLIPLEX MAP试剂盒检测巨噬细胞培养上清液。结果来自三个独立的实验。*和**表明差异显著（未配对t吨-测试，0.01<P（P）<0.05和0.001<P（P）分别<0.01）。
图7
图7
PDL1-IgG1Fc抑制巨噬细胞M1极化及其向CD8呈递疟疾抗原的能力+T细胞在体外.我们构建了巨噬细胞CD8+T细胞共孵育模型研究PDL1-IgG1Fc对巨噬细胞的影响。根据ELISA结果，PDL1-IgG1Fc处理的巨噬细胞显示IL-10分泌增加（A）IL-12p70分泌减少（B），肿瘤坏死因子-α（C）和IL-6（D）而抗PD1单克隆抗体可对抗PDL1-IgG1Fc对IL-10和IL-12p70的影响。此外，CD8中穿孔素和颗粒酶B mRNA的表达水平+与“pRBC+IFN-γ”组相比，PDL1-IgG1Fc处理后与巨噬细胞共同孵育的T细胞显著降低（E）这些结果表明PDL1-IgG1Fc抑制巨噬细胞M1极化及其向CD8呈递疟疾抗原的能力+体外T细胞。*和**表明差异显著（未配对t吨-测试，0.01<P（P）<0.05和0.001<P（P）分别<0.01）。
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