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.2019年1月25日；2（1）：e201800219。
doi:10.26508/lsa.201800219。 打印2019年2月。

蛋白质合成质量控制中缺陷引发的线粒体应激反应

吴伟·利希塔 1, Kah Ying Ng公司 1, 福米·索米 1, 保拉·马丁宁 1, 泰纳图伦 1, 克里斯托弗·杰克逊 2, 阿努·索马莱宁 2, 海伦娜·维希宁 1, 埃贾·约基塔洛 1, Tuula A Nyman公司 三, 玛丽塔·艾索卡利奥 4, 詹姆斯·斯图尔特 4, 塞西莉亚·曼奇尼 5, 阿尔弗雷多·布鲁斯科 5, 萨拉·塞内卡 6, 安妮·隆贝斯 7, 罗伯特·泰勒 8, 布伦丹·J·巴特斯比 9
附属机构

蛋白质合成质量控制中缺陷引发的线粒体应激反应

吴伟·利希塔等。 生命科学联盟. .

摘要

线粒体有一个专门用于合成氧化磷酸化所必需的膜蛋白的分区基因表达系统。需要有响应性的质量控制机制来确保异常的蛋白质合成不会破坏线粒体功能。阻碍由AFG3L2和截瘫组成的线粒体基质质控蛋白酶复合体功能的致病性突变会导致多方面的临床综合征。在细胞和分子水平上，这种质量控制复合物的缺陷是由线粒体形式和功能的损伤定义的。在这里，我们确定了这些表型的病因。我们展示了线粒体蛋白质合成质量控制的中断是如何触发顺序应激反应的，其特征首先是OMA1激活，然后是线粒体核糖体丢失和线粒体内膜超微结构重塑。用氯霉素抑制线粒体蛋白合成完全阻断了这种应激反应。总之，我们的数据建立了一种机制，将AFG3L2发病机制的主要细胞生物表型联系起来，并显示了线粒体蛋白合成的调节如何对细胞器内环境稳定产生有利影响。

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利益冲突声明

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数字

图1。
图1线粒体翻译应激反应调节OPA1和核糖体稳态。
（A）图示OMA1金属蛋白酶对膜栓系OPA1的应激诱导调节蛋白水解。（B）用含有（+）和不含（−）氯霉素（CA）的指定siRNA处理的人成纤维细胞全细胞裂解物的免疫印迹*AFG3L2抗体检测到非特异性条带。（C）通过四甲基罗丹明（TMRM）染色对HEK293细胞进行线粒体膜电位散点图分析，这些细胞经来自独立实验的指示siRNAs处理。CCCP是消散膜电位的积极控制。寡霉素（Oligomycin）抑制F1FO ATP合成酶，这会导致超极化，除非需要ATP水解来维持膜电位。（D）在光学显微镜下，用指示的带有或不带有CA的siRNAs处理的人成纤维细胞线粒体形态的散点图量化。数据来自三个独立实验，n=100。（E）用带有（+）和不带有（−）CA的指示siRNAs处理的人成纤维细胞的Southern blot。（F）三个独立实验中Southern印迹在（E）中的定量。数据表示平均值±标准偏差。（G）小鼠胚胎成纤维细胞的免疫印迹Afg3l2基因型在37℃下生长或在45℃下热休克4h，有（+）和无（−）CA.IM，内膜；S1，OMA1蛋白水解位点；SC，加扰。
图S1。
图S1线粒体蛋白质合成和OMA1激活。
（A）对HEK293全细胞裂解物进行免疫印迹，用带有（+）和不带有（−）氯霉素（CA）的指示siRNAs处理。电话2-1和电话2-2是两种不同的siRNA。（B）37°C下生长的小鼠胚胎成纤维细胞全细胞裂解物的免疫印迹（Anand等人，2014），含或不含CA。（C）在37°C下生长或在45°C下热休克4小时（含或不含CA）的情况下，对用所示siRNA处理的人成纤维细胞全细胞裂解物进行免疫印迹。（D）37°C下生长的小鼠胚胎成纤维细胞的全细胞裂解物的免疫印迹，或在45°C下热休克4小时（含或不含CA）。（E）37°C下生长的HEK293细胞系的全细胞裂解物的免疫印迹，或在45°C下热休克4小时（含或不含CA）。
图S2。
图S2.氧化磷酸化复合物组装中的缺陷或新合成的线粒体蛋白质的一般不稳定性不会激活OMA1。
（A）说明产生F的遗传方法的示意图1F类O（运行）不同严重程度的ATP合酶组装缺陷。（B）左边，HEK293细胞用指示的siRNAs处理，然后用代谢标记35S代表线粒体蛋白质合成。对，用指定的siRNAs处理人类成纤维细胞，然后用35S代表线粒体蛋白质合成。红色箭头表示MT-ATP6的迁移位置。（C）用指示的siRNA处理HEK293细胞的全细胞裂解物的免疫印迹。（D）具有致病性突变的人成纤维细胞COX10型逆转录病毒稳定转导的（T196K和P225L）：空载体或野生型COX10型cDNA。代谢标记的成纤维细胞线粒体蛋白合成35S-蛋氨酸/半胱氨酸合成，30分钟脉冲或30分钟脉冲，24小时冷追踪。蓝色箭头表示MT-CO1和MT-CO2的迁移位置，在没有COX10的情况下，它们是不稳定的。（E）37°C培养或45°C热休克4h后，用或不用氯霉素（CA）对全细胞裂解物（来自D）进行免疫印迹。（F）野生型线粒体DNA（mtDNA）或m.8344A>G tRNA具有相同核遗传背景的人类成肌细胞赖氨酸线粒体DNA突变3530分钟脉冲下线粒体蛋白质合成的S代谢标记。（G）人类成肌细胞全细胞裂解物的免疫印迹（F）。细胞在37°C下生长或在45°C下热休克4小时，添加（+）和不添加（−）CA。SC，加扰控制。
图2。
图2异常线粒体mRNA翻译过程中的热休克触发线粒体应激反应。
（A）人MT-ATP6图，说明了蛋白质中致病性突变的位置以及患者成纤维细胞中突变的异质性水平。（B）患者成纤维细胞全细胞裂解物的免疫印迹MT-ATP6型突变和WT对照。（C）30分钟脉冲代谢标记35患者成纤维细胞线粒体蛋白合成的S-蛋氨酸/半胱氨酸MT-ATP6型突变。（D）成纤维细胞全细胞裂解物的免疫印迹MT-ATP6型突变在45°C下用（+）和不用（−）氯霉素热休克4小时。
图S3。
图S3.人类成纤维细胞中的线粒体呼吸。
（A）用指示的siRNA处理的人成纤维细胞最大耦合呼吸散点图。显示了独立实验的数据点；线表示平均值。（B）用如（A）所示的siRNA处理的人成纤维细胞中的线粒体质子泄漏。（C）野生型人成纤维细胞的代表性耗氧痕迹。（D）具有如（C）中所示的MT-ATP6基因型的人成纤维细胞的代表性氧消耗痕迹。（E）具有MT-ATP6基因型的人成纤维细胞的代表性耗氧痕迹，如（C）所示。（F）用递增剂量的寡霉素（10 nM、50 nM和250 nM）处理具有MT-ATP6基因型的人成纤维细胞的代表性耗氧痕迹，以测试F的丰度1F类O（运行）ATP合成酶。寡霉素在MT-ATP6和ATP9的界面上结合。sc，加扰；Dig，洋地黄素；MP、苹果酸/丙酮酸盐；细胞色素c；琥珀酸；OM，寡霉素；腐烂、鱼藤酮；Ama，抗霉素A；叠氮，叠氮；FCCP，羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙；和TMPD、N，N′，N′-四甲基对苯二胺。
图3。
图3异常线粒体mRNA翻译过程中的热休克激活OMA1和核糖体衰变途径。
（A）全细胞裂解物的免疫印迹MT-ATP6型m.9205delTA成纤维细胞。（B）左图，全细胞裂解物的免疫印迹MT-ATP6型m.9205delTA成纤维细胞。对，来自三个独立实验的免疫印迹的定量。数据表示平均值±标准偏差。（C）左，来自MT-ATP6型m.9205delTA成纤维细胞。对，来自四个独立实验的Northern印迹定量。数据表示平均值±标准偏差。（D）线粒体DNA拷贝数的Southern印迹代表性图像MT-ATP6型来自多个独立实验的m.9205delTA成纤维细胞。（E）定量无标签液相色谱-质谱/质谱分析野生型和野生型大（LSU）和小（SSU）亚基的线粒体核糖体亚基MT-ATP6型m.9205delTA成纤维细胞在37°C下生长或在45°C下热休克4小时。每个数据点代表一个线粒体核糖体蛋白。数据是从五个独立实验中分离的线粒体收集的，每个基因型和温度条件。（F）人成纤维细胞全细胞裂解物的免疫印迹MT-ATP6型基因型在37°C培养或45°C热休克指定时间后用指定的翻译抑制剂处理。茴香霉素抑制细胞质核糖体的翻译伸长。
图4。
图4：在热休克期间，异常线粒体mRNA的翻译对蛋白质合成产生负调节。
（A）演示实验工作流的示意图35热休克期间线粒体蛋白质合成的S-蛋氨酸/半胱氨酸代谢标记。所有细胞都用脉冲标记35S-蛋氨酸/半胱氨酸30分钟，在45°C的指定培养时间后测量线粒体蛋白质合成。（B）顶部，具有代表性的代谢标记35热休克期间S-蛋氨酸/半胱氨酸在人成纤维细胞中的表达MT-ATP6型基因型。以下，量化35热休克时S并入线粒体蛋白。数据表示四个独立实验的平均值+SD。a.u.，任意单位。（C）人类成纤维细胞MT-ATP6型带有野生型空载体的逆转录病毒稳定地转导了m.9205delTA基因型AFG3L2型或E575Q AFG3L2型cDNA。45°C下热休克4 h的细胞全细胞裂解物的免疫印迹*AFG3L2抗体检测到非特异性条带。（D）量化35S-掺入人成纤维细胞线粒体蛋白MT-ATP6型m.9205delTA基因型（来自C）。数据表示四个独立实验的平均值±SD。所有数据都代表了多个独立的实验。
图5。
图5 AFG3L2功能障碍重塑线粒体内膜超微结构。
（A）具有代表性的人类成纤维细胞透射电镜照片MT-ATP6型用siRNAs处理的基因型。SC，加扰序列。（B）通过电子断层模型从三个角度对用指定的siRNA处理的野生型对照人类成纤维细胞进行线粒体内膜形态学研究。数字表示沿单个嵴内陷在不同方向上的嵴连接位置。（C）与（B）相同，但在人类成纤维细胞中MT-ATP6型基因型。IMS，膜间空间。
图S4。
图S4线粒体形态的透射电子显微照片，F断裂1F类O（运行）ATP合成酶组装。
（A）用指示的siRNA处理的化学固定小鼠胚胎成纤维细胞的典型透射电镜照片。ATP5B是F的一个重要结构亚单位1.（B）用所示siRNA处理的化学固定的人类成纤维细胞的典型透射电子显微照片。（C）化学固定的人成纤维细胞的典型透射电镜照片MT-ATP6型突变m.8611insC（Leu29Profs*36）。（D）化学固定的人成纤维细胞纯合细胞在TMEM70中c.317-2A>G突变的代表性透射电镜照片，TMEM70是F的一个组装因子1F类O（运行）ATP合成酶。SC，加扰的对照siRNA。
图6。
图6线粒体蛋白质合成的整体缺陷重塑了嵴的超微结构。
（A）用指示的siRNAs和氯霉素（CA）处理的人成纤维细胞的典型透射电镜照片。（B）具有相同核遗传背景的人类成肌细胞的代表性透射电子显微照片，其野生型线粒体DNA（mtDNA）或m.8344A>G tRNA为同质赖氨酸突变。（C）一名患有致病性突变的患者的人成纤维细胞的典型透射电镜照片65的C12用空向量或野生型稳定转导65的C12cDNA。右下角，用所示抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。（D）具有代表性的人类成纤维细胞透射电镜照片MT-ATP6型m.9205delTA突变在45°C下热休克4小时。（E）光镜下用散射图定量测定人成纤维细胞线粒体形态MT-ATP6型m.9205delTA突变在37°C下生长或在45°C下热休克4小时，有无CA。数据来自三个独立的实验。SC，加扰序列。
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