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。2018年12月24:11:201-215。
doi:10.2147/CMAR。第190694条。 2019年eCollection。

MARCH5过度表达有助于肿瘤生长和转移，并与乳腺癌的低生存率相关

海利堂 1, 彭淑嘉 1, 董燕明（Yanming Dong） 1, 杨晓军 1, 杨平 1, 林阳（Lin Yang） 1, 杨冰（Bing Yang） 2, 《国强报》 1
附属公司

MARCH5过度表达有助于肿瘤生长和转移，并与乳腺癌的低生存率相关

海利堂等。 癌症管理研究。 。

摘要

背景：人类MARCH5是一种线粒体定位的E3泛素蛋白连接酶，对线粒体动力学的调节至关重要。大量证据表明，线粒体动力学失衡与癌症之间存在密切联系。然而，MARCH5在乳腺癌（BC）中的表达、生物学功能和预后意义尚未确定。

材料和方法：通过实时定量PCR和Western blot分析，检测癌细胞株和肿瘤组织中MARCH5的mRNA和蛋白表达。评估65例BC患者MARCH5的临床预后意义。MARCH5的生物学功能通过体外细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭试验以及体内肿瘤生长和转移试验来确定，通过敲除或过度表达MARCH5BC细胞来确定。此外，还探讨了MARCH5调节BC细胞生长和转移的潜在机制。

结果：MARCH5在BC细胞中显著上调，主要是由于miR-30a的下调，导致BC患者的生存率较低。MARCH5通过诱导G1-S细胞周期阻滞和上皮-间充质转化，在体内外促进了BC细胞的生长和转移。机械研究表明，MARCH5的致癌作用主要由BC细胞线粒体分裂增加和随后ROS生成介导。

结论：我们的研究结果表明，MARCH5在BC细胞中起着关键的致癌作用，这为MARCH5B作为BC治疗的潜在治疗靶点提供了实验证据。

关键词：不列颠哥伦比亚省；3月5日；入侵；预后；增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露作者报告在这项工作中没有利益冲突。

数字

图1
图1
MARCH5在BC细胞中上调，导致预后恶化。笔记：(A类和B类)定量实时PCR和Western blot分析五种BC细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MCF-7和T47D）和两种非恶性人类乳腺细胞系（MCF 10A和MCF 12A）中MARCH5的表达。(C类和D类)定量实时PCR和Western blot检测18对BC肿瘤组织和瘤周组织（T，肿瘤；P，瘤周）中MARCH5的表达。比例尺，50µm。肿瘤与瘤周MARCH5的相对表达率为log2转化。(E类)65名BC患者肿瘤和瘤周组织中MARCH5的代表性免疫组织化学（IHC）染色图像（左面板，比例尺，50µm）和染色强度（右面板）。(F类)根据MARCH5表达水平对65例BC患者进行生存分析的Kaplan-Meier曲线。(G公司)利用在线门户网站UALCAN对不列颠哥伦比亚省MARCH5进行预测意义分析(http://ualcan.path.uab.edu). *P（P）<0.05.缩写：不列颠哥伦比亚省，乳腺癌。
图2
图2
MARCH5基因敲除通过诱导G1-S细胞周期阻滞抑制BC细胞生长。笔记：(A类)转染siMARCH5或siCtrl的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的MTS细胞活力分析。(B类)如图所示，对BC细胞进行集落形成分析。(C类)以流式细胞术为基础对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞进行细胞周期分析，并按指示进行治疗。(D类)EdU掺入试验，用于测定BC细胞中的细胞增殖，并按指示进行处理。比例尺，50µm。(E类)Annexin V/PI染色用于BC细胞的细胞凋亡分析，并按指示进行治疗。(F类)Western blot分析BC细胞细胞质和线粒体中细胞色素c（cyt c）水平，并按指示进行处理。β-肌动蛋白和COX IV是细胞质（细胞）和线粒体（线粒体）的负荷控制因子。(G公司)Western blot分析所示治疗后BC细胞中裂解caspase 9和caspase 3的水平*P（P）<0.05.缩写：BC，乳腺癌；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷；PI，碘化丙啶；ns，不显著。
图3
图3
MARCH5基因敲除通过抑制EMT抑制BC细胞的迁移和侵袭能力。笔记：(A类和B类)在转染siMARCH5或siCtrl（siMARCH2，siRNA对抗MARCH5siRNA；siCtrl，对照siRNA）后，通过伤口愈合迁移和MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的Matrigel侵袭试验评估细胞迁移和侵袭。比例尺，50µm。(C类和D类)通过qRT-PCR和Western blot分析评估EMT标记在按指示处理的BC细胞中的表达。(E类和F类)通过qRT-PCR分析，评估按指示处理的BC细胞中四种基质金属蛋白酶（MMPs）的mRNA水平*P（P）<0.05.缩写：BC，乳腺癌；EMT，上皮-间质转化；qRT-PCR，定量实时PCR。
图4
图4
MARCH5基因敲除抑制体内乳腺癌的生长和转移。笔记：(A类)由MDA-MB-231细胞与稳定的MARCH5敲除细胞或对照细胞建立的皮下异种移植物的生长。shMARCH5，针对MARCH5的shRNA表达载体；shCtrl，控制shRNA(B类)比较shMARCH5组和shCtrl组小鼠肿瘤的重量。(C类和D类)通过IHC分析检测两组皮下异种移植物肿瘤中MARCH5和Ki-67的表达水平。比例尺，10µm。(E类)显示了各组肺转移灶的代表性图像和数量。比例尺，10µm*P（P）<0.05.
图5
图5
MARCH5的强制表达促进了BC细胞的生长和转移。笔记：(A类和B类)用MARCH5表达载体或空载体（EV）转染MCF-7和T47D细胞后，分析MTS细胞活力和集落形成。(C类)以流式细胞术为基础的BC细胞周期分析。(D类)用EdU掺入法分析BC细胞中的细胞增殖情况，并按指示进行处理。比例尺，20µm。(E类)用流式细胞仪分析所示处理的BC细胞的凋亡情况。(F类和G公司)按指示处理BC细胞的伤口愈合迁移和跨井Matrigel侵袭检测。比例尺，50µm*P（P）<0.05.缩写：BC，乳腺癌；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷；EV，空向量；ns，不显著。
图6
图6
MARCH5的过度表达主要由miR-30a的下调介导。笔记：(A类和B类)用合成的miR-30a前体转染MCF-7和T47D细胞后，通过实时定量PCR和Western blot检测MARCH5的表达。(C类)在18例BC肿瘤组织中测定了MARCH5和miR-30a mRNA水平的相关性。(D类和E类)对按指示处理的MCF-7和T47D细胞中的MTS细胞活力和集落形成进行分析。(F类和G公司)按指示处理的MCF-7和T47D细胞的伤口愈合迁移和跨阱Matrigel侵袭检测。比例尺，50µm*P（P）<0.05.缩写：BC，乳腺癌；EV，空矢量。
图7
图7
MARCH5通过提高线粒体裂变介导的活性氧生成促进肿瘤生长和转移。笔记：(A类)左幅：MARCH5敲除的MDA-MB-231细胞和MARCH5+过表达的MCF-7细胞的典型线粒体形态。比例尺，1µm。右侧面板：对BC细胞（每个样本30个细胞）的碎片、中间和小管比例进行量化。(B类)用流式细胞术测定按指示处理的BC细胞内的ROS水平。(C类和D类)用H处理BC细胞，分析MTS细胞的存活率和集落形成能力2O（运行）2（90µM，12小时）或NAC（30µM、12小时），如图所示。(E类和F类)用H处理的BC细胞的伤口愈合和transwell基质胶侵袭试验2O（运行）2（90µM，12小时）或NAC（30µM、12小时），如图所示。比例尺，50µm。(G公司)MARCH5上调在BC肿瘤生长和转移中的致癌作用及其潜在机制示意图*P（P）<0.05.缩写：BC，乳腺癌；EV，空矢量。
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