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.2018年12月7:13:450-463。
doi:10.1016/j.omtn.2018.09.019。 Epub 2018年9月29日。

星形胶质细胞EV诱导的lincRNA-Cox2调节小胶质细胞吞噬作用：吗啡介导的神经变性的意义

胡国库 1, 科里奥 2, 方牛 2, 陆洋 三, 布莱克·W·达隆 2, 香农·卡伦 2, 长海田 4, 姜树 5, 崔娟 5, 孙志强 6, 尤里·柳先科 6, Minhan Ka公司 7, 陈显明（Xian-Ming Chen） 8, Shilpa Buch公司 9
附属公司

星形胶质细胞EV-Induced lincRNA-Cox2调节小胶质细胞吞噬作用：吗啡介导的神经退行性变的意义

胡国库等。 摩尔热核酸. .

摘要

小胶质细胞功能受损，如吞噬作用和/或免疫反应失调，被认为是各种神经退行性疾病发病机制中的潜在因素。我们以前的研究表明，长基因间非编码RNA（lincRNA）-Cox2的表达受核因子κB（NF-κB）信号转导的影响，并作为转录因子的辅激活子调节小胶质细胞中大量免疫相关基因的表达。细胞外小泡（EV）被认为是细胞间通信和细胞调节的主要促进剂。在此，我们表明，来自暴露于吗啡的星形胶质细胞的EV可被小胶质细胞内体摄取，进而激活Toll样受体7（TLR7），随后上调lincRNA-Cox2表达，最终导致小胶质细胞吞噬功能受损。这在体内得到了进一步验证，与对照小鼠相比，从服用吗啡的小鼠分离的脑片中也观察到了小胶质细胞吞噬活性的抑制。此外，我们还表明，鼻内注射含有lincRNA-Cox2 siRNA（小干扰RNA）的EVs能够恢复吗啡给药小鼠的小胶质细胞吞噬活性。这些发现对开发基于EV的RNA治疗药物以治疗涉及小胶质细胞功能损害的各种疾病具有影响。

关键词：中枢神经系统；药物滥用；外体；胞外囊泡；lincRNA；小胶质细胞；吗啡；吞噬作用。

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数字

图1
图1
从星形胶质细胞培养物中分离出的EV的特性（A）从星形细胞培养物分离EV的主要步骤示意图。（B） 星形胶质细胞EVs的Western blot特征。从星形胶质细胞EVs分离的蛋白质在SDS-PAGE上分离，并在硝酸纤维素膜上电印迹。用抗TSG101、CD63和Alix的胞外体标记抗体检测印迹。Calnexin被用来控制细胞碎片污染。（C） 从A172细胞分离出的EV的代表性电子显微照片。比例尺，200 nm。（D） 从小鼠原代星形胶质细胞培养上清中分离出的EV的AFM图像。（E） 通过NanoSight跟踪分析（NTA）从细胞培养中分离的EV的尺寸和颗粒分布图。该曲线图显示了对于隔离的EV而言在80nm左右的峰值尺寸。（F） 从对照组和吗啡暴露的人类原代星形胶质细胞中分离出的EV数量。所有实验都至少独立进行了三次。数据显示为平均值±SEM。*与对照组相比，p<0.05。
图2
图2
EVs被小胶质细胞内化并定位于晚期内切体（A和B）。小鼠原代小胶质细胞与从pEF6.mCherry-TSG101转染的小鼠原代星形胶质细胞纯化的EVs孵育20分钟。对多聚甲醛固定的小胶质细胞进行渗透，并对其进行（A）Iba1或（B）EEA1染色，然后进行FITC-结合二级抗体染色，并用荧光显微镜观察。比例尺，10μm。（C） 条形图显示包含各种数量的AU-或GU-丰富基序的miRNA（浅蓝色）和EV-miRNA（红色）的数量。（D） EV miRNA富含AU和GU基序的序列标志。（E） 来自对照组和吗啡刺激的人类原代星形胶质细胞EV中富含AU和GU的miRNAs表达谱的热图。（F） qPCR验证从RNA-seq中鉴定的代表性差异表达miRNAs。所有实验都至少独立进行了三次*与对照组相比p<0.05。
图3
图3
从暴露于吗啡的星形胶质细胞释放的EVs诱导NF-κB（A和B）野生型（A）和TLR7 KO（B）小鼠原代小胶质细胞的核转移5细胞）从暴露于吗啡的星形胶质细胞中分离30分钟。使用抗p65抗体（绿色）通过间接免疫荧光观察内源性p65的亚细胞定位。DAPI染色显示细胞核DNA。比例尺，50μm。（C和D）用对照或Dicer-siRNA转染原代小鼠星形胶质细胞24小时，然后吗啡暴露24小时。将野生型（C）和TLR7 KO（D）小鼠小胶质细胞暴露于从星形胶质细胞条件培养基中分离的EVs（30分钟），然后通过western blot检测核组分中的NF-κB p65。（E） 所有实验都至少独立进行了三次。分别针对β-肌动蛋白和组蛋白H3对细胞质和细胞核提取物的谱带强度进行量化和归一化，并与未经处理的细胞进行比较。所有数据均以平均值±标准差表示。*p<0.05与使用Student t检验的对照组相比。
图4
图4
吗啡星形胶质细胞EV介导的lincRNA-Cox2诱导涉及TLR7和NF-κB（A）。小鼠原代小胶质细胞预先用TLR7抑制剂（氯喹25μM）或NFκB抑制剂（SC-514，5μM）处理1小时，然后细胞暴露于EV 4小时（EV每2×10 2μg5细胞）从星形胶质细胞条件培养基中分离。通过实时PCR分析从细胞中分离的总RNA中lincRNA-Coox2的表达。（B） 从野生型和TLR7 KO幼鼠分离小鼠初级小胶质细胞，并将其暴露于从吗啡刺激星形胶质细胞条件培养基分离的EV中4小时。用实时PCR分析细胞总RNA表达lincRNA-Cox2。（C） 使用lincRNA-Cox2（红色）特异探针结合DAPI染色（蓝色）和小鼠原发性小胶质细胞GAPDH（绿色）免疫染色进行ISH分析的典型共焦图像。比例尺，10μm。（D） 亚细胞分离后qPCR检测lincRNA-Cox2、U1 snRNA和GAPDH mRNA。所有数值均显示为平均值±SEM。*与对照组相比p<0.05#与治疗组相比p<0.05。
图5
图5
敲除lincRNA-Cox2恢复EV介导的小胶质细胞吞噬功能损伤（A）用lincRNC-Cox2 siRNA转染小胶质细胞中lincRNA-Cox2的实时PCR。（B）与对照细胞相比，lincRNE-Cox2敲除BV-2细胞中差异表达的吞噬相关基因的热图。（C） 用lincRNA-Cox2 siRNA转染小鼠原代小胶质细胞24小时，然后将细胞暴露于星形胶质细胞EVs 4小时，然后通过qPCR评估Lrp、Pld2和Syk的表达。（D和E）用TLR7抑制剂（氯喹25μM）或NF-κB抑制剂（SC-514，5μM）预处理小鼠原代小胶质细胞1小时，然后将细胞暴露于星形胶质细胞EV，随后暴露于荧光珠2小时。使用（D）荧光显微镜（标尺，20μm；高倍图像显示在右下角）和（E）荧光板阅读器测量吞噬作用。（F） TLR7 KO小胶质细胞暴露于星形胶质细胞衍生的EV，并如上所述评估吞噬作用。所有数据均以平均值±标准差表示。*与对照组相比，p<0.05；#与使用Student t检验的治疗相比，p<0.05。
图6
图6
敲除lincRNA-Cox2改善吗啡介导的小胶质细胞吞噬活性损伤在体内（A） 将PKH26标记的EVs（20μg）经鼻注入WT小鼠（n=3）。在治疗后4小时和24小时处死小鼠，并使用Xenogen IVIS 200成像仪对采集的器官进行成像。右侧显示了辐射效率的刻度。（B） 对注射PKH26标记EVs的小鼠脑切片进行免疫染色，以检测小胶质细胞标记物Iba1（绿色）。显示了具有代表性的显微照片（原始放大倍数×20）。比例尺，100μm。（C） CD11b中lincRNA-Cox2的实时PCR+/CD45型+从不同组小鼠的大脑中分离出数量不多的小胶质细胞。（D） 用荧光珠（绿色）孵育的8周龄小鼠脑片的典型显微照片。比例尺，20μm。（E） 定量Iba1阳性（红色）小胶质细胞（含吞噬颗粒）的数量归一化为Iba1阴性细胞的总数。n=三只老鼠的20个视野。所有数据均以平均值±SD表示*与生理盐水/si对照组相比p<0.05；#使用Student t检验，与吗啡/si对照组相比，p<0.05。
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