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。2019年6月；234(6):9052-9064.
doi:10.1002/jcp.27583。 Epub 2018年10月30日。

Foxm1是TGF-β通过Smad2/3在内皮细胞中诱导EndMT的关键驱动因子，并与蜗牛启动子结合

帅松 1, Rui Zhang（张瑞） 1, 魏曹 1, 郭建芳 1, 易余 2, 伊万 1, 王传辉 三, 李一钢 1, 王群山 1
附属机构

Foxm1是TGF-β通过Smad2/3诱导内皮细胞EndMT的关键驱动因素，并与Snail启动子结合

帅松等。 J细胞生理学。 2019年6月。

摘要

内皮-间充质转化（EndMT）首次在心脏发育中被报道。最近的研究表明，EndMT也发生在心脏纤维化的进展中。在此，我们证明了Forkhead Box M1（Foxm1）转录因子在内皮细胞（EC）中转化生长因子β（TGF-β）诱导的EndMT中的关键作用以及可能的潜在分子机制。TGF-β刺激后在内皮细胞中诱导Foxm1。使用药理学和分子方法抑制Foxm1功能可以减弱TGF-β诱导的EndMT和细胞迁移。相反，慢病毒介导的Foxm1过度表达使EndMT继续进行，尽管内皮细胞中没有TGF-β。此外，我们发现Smad2/3信号通路和EndMT相关转录因子的激活在Foxm1介导的EndMT的发病机制中起着重要作用。进一步分析表明，Foxm1结合并增加了编码EndMT关键转录调控因子的蜗牛基因的启动子活性。总之，我们的结果确定FOXM1是TGF-β诱导的EndMT的驱动因素，并强调以FOXM1为靶点治疗心脏纤维化的潜力。

关键词：末端MT；Foxm1；转化生长因子-β1；心肌纤维化；蜗牛。

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数字

图1
图1
TGF-β1在培养的原代HUVEC中诱导EndMT。（a） 代表性相位光镜图像显示了接触TGF-β1（10 纳克/毫升）48 hr.比例尺 = 200 微米。（b） 通过免疫荧光分析细胞内皮细胞（ECs）标记物CD31（红色）和成纤维细胞标记物波形蛋白（绿色）和细胞核（DAPI：蓝色）的表达。比例尺 = 100 微米。（c） 通过qRT-PCR评估内皮细胞标记物CDH5、CD31和间充质/肌纤维母细胞标记物波形蛋白、ACTA2和FSP1的相对mRNA表达水平。（d） TGF‐β1治疗后，通过western blot分析测定VE‐钙粘蛋白：CD31：波形蛋白：α‐SMA和FSP1的蛋白质水平和密度定量48 hr.数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01：和***第页 < 0.001与相应的Ctrl组。α‐SMA：α‐平滑肌肌动蛋白；DAPI:4′：6-二氨基-2-苯基吲哚；EndMT：内皮-间充质转化；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；mRNA：信使RNA；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；TGF-β1：转化生长因子β1
图2
图2
TGF-β1治疗后Foxm1表达增加，Foxm1-抑制剂Sio A可减轻TGF-α1诱导的HUVEC EndMT。（a） 通过qRT‐PCR评估暴露于对照条件（未刺激）或TGF‐β1的48个HUVEC中FoxmRNA的表达 hr.（b）在相同条件下通过western blot评估Foxm1蛋白水平。（c） 通过western blot评估VE‐钙粘蛋白：CD31：波形蛋白、α‐SMA和FSP1的相对蛋白水平。（d） d是c的定量分析。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01：和***第页 < 0.001与相应的Ctrl组。# 第页与相应TGF-β1组相比<0.05。α‐SMA：α‐平滑肌肌动蛋白；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；mRNA：信使RNA；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；Sio A：丝裂霉素A；TGF-β1：转化生长因子β1
图3
图3
TGF-β1治疗后Foxm1表达增加，Foxm1-抑制剂Sio A可减轻TGF-α1诱导的MAEC EndMT。（a） 通过qRT‐PCR评估暴露于对照条件（未刺激）或TGF‐β1 48 hr.（b）在相同条件下通过western blot评估Foxm1蛋白水平。（c） 通过western blot评估VE‐钙粘蛋白：CD31：波形蛋白、α‐SMA和FSP1的相对蛋白水平。（d） d是c的定量分析。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01：和***第页 < 0.001与相应的Ctrl组。# 第页与相应的TGF-β1组相比，<0.05。α‐SMA：α‐平滑肌肌动蛋白；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；MAECs：小鼠主动脉内皮细胞；mRNA：信使RNA；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；Sio A：丝裂霉素A；TGF-β1：转化生长因子β1
图4
图4
用shRNA沉默Foxm1可减弱TGF-β1诱导的HUVEC末端MT和迁移。（a，b）通过qRT-PCR和western blot验证了Foxm1三个不同干扰序列的敲除效率。（c） 通过western blot评估VE‐钙粘蛋白、CD31、波形蛋白、α‐SMA和FSP1的相对蛋白水平。（d） d是c.（e）细胞的定量分析，通过免疫荧光分析CD31（红色）、波形蛋白（绿色）和细胞核（DAPI：蓝色）的表达。比例尺：200 微米。（f） Foxm1沉默可改善TGF-β1诱导的细胞迁移。比例尺，50 微米。（g） 通过western blot评估磷酸化PTK2的表达，并相对于总PTK2表达进行量化。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01与相应的Ctrl组相比。# 第页与相应的TGF-β1组相比，<0.05。α‐SMA，α‐平滑肌肌动蛋白；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；PTK2：蛋白酪氨酸激酶2；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；shRNA：短发夹RNA；TGF-β1：转化生长因子β1
图5
图5
TGF-β2处理后Foxm1表达增加，用shRNA沉默Foxm1-可以减轻TGF-α2诱导的HMECs EndMT。（a） 通过qRT-PCR评估暴露于对照条件（未刺激）或TGF-β2的HMEC中Foxm1 mRNA表达48 hr.（b）在相同条件下通过western blot评估Foxm1蛋白水平。（c） 通过western blot评估VE‐钙粘蛋白、CD31：波形蛋白：α‐SMA：和FSP1的相对蛋白水平。（d） d是c的定量分析。数据以平均值表示 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001与相应的Ctrl组。# 第页与相应的TGF-β2组相比<0.05。α‐SMA，α‐平滑肌肌动蛋白；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；HMECs：人微血管内皮细胞；信使核糖核酸：信使核糖核酸；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；shRNA：短发夹RNA；TGF-β2，转化生长因子β2
图6
图6
Foxm1过度表达可诱导HUVEC中的EndMT。（a，b）对转染Foxm1过表达质粒的细胞中Foxm1的表达进行qRT-PCR和western blot分析 hr.（c）通过western blot检测转染FOXM1过表达质粒的细胞中VE‐钙粘蛋白、CD31：波形蛋白、α‐SMA：和FSP1的相对蛋白水平，以检测48个 hr.（d）d是c的定量分析。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05: **第页 < 0.01与相应的Ctrl组相比。α‐SMA：α‐平滑肌肌动蛋白；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；FSP1：成纤维细胞特异性蛋白-1；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；OE：过度表达；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应
图7
图7
Foxm1调节EndMT相关转录因子的表达，并可直接激活Snail1启动子。（a，b）HUVEC中具有代表性的EndMT相关转录因子mRNA（a）和蛋白质（b）水平。（c） 所示各组HUVEC中p‐Smad2/3和总Smad2/3蛋白水平的代表性western blot和定量结果。（d） 在TGF‐β1治疗后，Foxm1直接与Snail1启动子区结合。数据表示为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001与相应的Ctrl组。# 第页与相应的TGF-β1组相比，<0.05。EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；人脐静脉内皮细胞；mRNA、信使RNA；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；TGF-β1：转化生长因子β1
图8
图8
工作假设的示意图。Foxm1通过Smad2/3信号通路促进内皮细胞中TGF-β1诱导的EndMT过程，并直接结合和诱导蜗牛基因：一种EndMT促进转录因子。内皮细胞：内皮细胞；EndMT：内皮-间充质转化；Foxm1：叉头箱M1；Sio A：丝裂霉素A；转化生长因子-β；TGF-βR：转化生长因子β受体；TSS：转录起始位点
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