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。2018年12月10日；93（1）：e01330-18。
doi:10.1128/JVI.01330-18。 2019年1月1日印刷。

DNA复制对FAM111A介导的猿猴病毒40宿主范围表型的贡献

Roxana M Tarnita公司 1 2, 阿德里安·威尔基 1 三, 詹姆斯·迪卡普里奥 4 2 5
附属机构

DNA复制对FAM111A介导的猿猴病毒40宿主范围表型的贡献

罗珊娜·M·塔尼塔等。 J维罗尔。 。

摘要

猴病毒40（SV40）的宿主范围（HR）突变体包含大T抗原C末端的突变，不能有效复制或在限制性细胞类型中形成斑块。HR突变病毒在病毒生命周期的几个阶段表现出损伤，包括早期和晚期基因和蛋白质表达、DNA复制和病毒粒子组装，尽管这些缺陷的潜在机制尚不清楚。宿主蛋白FAM111A的缺失可挽救SV40 HR病毒的早期和晚期基因表达和斑块形成，已被证明在细胞DNA复制中发挥作用。SV40病毒DNA复制发生在病毒复制中心受感染细胞的细胞核中，病毒蛋白和细胞复制因子位于此处。在这里，我们检测了病毒复制中心形成和DNA复制在FAM111A介导的HR表型中的作用。我们发现SV40 HR病毒很少在限制性细胞中形成病毒复制中心，FAM111A缺失可以挽救这种表型。此外，虽然FAM111A以细胞周期依赖性的方式定位于未感染细胞的核仁，但在感染SV40野生型或HR病毒后，FAM111A重新定位到病毒复制中心。我们还发现，通过蚜虫灵治疗或通过使用复制缺陷型SV40突变体抑制病毒DNA复制，可以减少FAM111A缺失对病毒基因表达的影响。这些结果表明，FAM111A限制SV40 HR病毒复制中心的形成，病毒DNA复制有助于FAM111A-介导的早期基因表达效应。重要性SV40已成为了解基本病毒和细胞过程的强大工具；然而，尽管进行了广泛的研究，SV40HR突变体表型仍然知之甚少。大T抗原C末端的突变破坏了与宿主蛋白FAM111A的结合，使SV40 HR病毒无法在限制性细胞类型中复制。我们的工作揭示了HR突变病毒在形成病毒复制中心方面的缺陷，可以通过耗尽FAM111A来挽救。此外，抑制病毒DNA复制可降低FAM111A限制对病毒基因表达的影响。此外，FAM111A是一种特征不佳的细胞蛋白，其突变导致两种严重的人类综合征，即Kenny-Caffey综合征和骨颅狭窄。我们关于FAM111A在限制病毒复制中的作用及其在核仁和病毒复制中心的定位的发现，为FAM111A的功能提供了进一步的见解，这可能有助于揭示潜在的疾病相关机制。

关键词：DNA复制；基因表达；核仁；猴病毒40；病毒复制；病毒-宿主相互作用。

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数字

图1
图1
SV40宿主范围突变体在病毒复制中心形成方面存在缺陷。（A至D）模拟感染的U2OS-ctrl（A）、SV40 WT感染的U2AS-ctrl（B）、SV40-HR684感染的U2-OS-ctr1（C）和SV40-WT感染或SV40-HR 684感染U2OS-KD（D）的免疫荧光染色。细胞在MOI为15时被感染，用20脉冲 5人的mM EdU 在感染后指定时间固定前min，然后用DAPI和抗LT抗体进行染色。所有样品的单个光学切片在×100倍的旋转圆盘共焦显微镜下成像。比例尺，20μm。
图2
图2
FAM111A限制SV40宿主范围病毒复制中心的形成和频率。（A和B）感染SV40 WT或HR684的LT-阳性U2OS-ctrl和U2OS-KD细胞百分比图（A）和感染SV40 WM或HR68的病毒复制中心阳性U2OS-ctrl及U2OS-KD细胞的百分比图（B）。细胞在MOI为15时被感染，在感染后的指定时间固定，并用DAPI和LT抗体染色。所有样品均通过放大×20倍的表观荧光显微镜成像，并使用ImageJ软件定量。定量是两个独立实验的平均值。
图3
图3
FAM111A以细胞周期依赖的方式定位于核仁。（A和B）G中U2OS-ctrl（A，顶部）或U2OS-KD（A，底部）和同步化HFF细胞（B）的免疫荧光染色0，早期G1，G1/S、 和S相。用DAPI和核仁蛋白和FAM111A抗体对细胞进行染色。所有样品的单个光学切片均采用旋转圆盘共焦显微镜在×100倍放大率下成像。比例尺，20μm。（C） 富集G的同步化HFF细胞的Western blot0，早期G1，G1/S、 用FAM111A和vinculin负荷控制抗体进行S期印迹。
图4
图4
FAM111A与LT在WT和HR684病毒复制中心共定位。在72 hpi（A）处用WT SV40（顶部）或HR684（中部和底部）感染U2OS-ctrl细胞，在72 hpi（B）处用SV40 WT（顶部）和SV40 HR684感染HFF细胞的免疫荧光染色。细胞在MOI为15时被感染，并用DAPI和LT和FAM111A抗体染色。所有样品的单片光学切片均在×100倍的共焦显微镜下成像。白色箭头表示病毒复制中心。比例尺，20μm。
图5
图5
抑制细胞和病毒DNA复制会影响FAM111A介导的宿主范围突变体的早期基因表达表型。所示为U2OS-ctrl和U2OS-KD细胞经10 μM蚜虫精或二甲基亚砜，MOI为15时感染SV40 WT或SV40 HR684或模拟感染。在48 hpi时采集细胞，进行裂解，并用LT、FAM111A和vinculin负荷控制抗体进行免疫印迹。
图6
图6
SV40 LT复制缺陷突变影响FAM111A介导的宿主范围突变体的早期基因表达表型。（A和B）用SV40 WT或HR684复制活性亲本基因组转染的U2OS-ctrl或U2OS-KD（A）和CV-1P-ctrl或CV-1P-KD（B）细胞裂解产物的Western blot，或含有复制活性LT点替代突变D474N、K550A和A149V的基因组。在48小时收获细胞，裂解，并用抗体进行免疫印迹，以进行LT和长春花蛋白负载控制。
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