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.2018年11月2日；293(44):16953-16963.
doi:10.1074/jbc。RA118.005640。 Epub 2018年9月20日。

PHARC相关丝氨酸水解酶ABHD12的生化特性揭示了其对超长链脂质的偏好

阿拉米·乔希 1, Minhaj谢赫 2, 舒巴姆·辛格 1, 阿比纳亚·拉金德兰 1, 阿莫尔·姆赫特雷 1, Siddhesh S Kamat公司 三
附属机构

PHARC相关丝氨酸水解酶ABHD12的生化特性揭示了其对超长链脂质的偏好

阿拉米·乔希等。 生物化学杂志. .

摘要

多发性神经病、听力损失、共济失调、色素性视网膜炎和白内障（PHARC）是一种罕见的遗传性人类神经系统疾病，由基因突变导致阿布哈德12编码完整膜丝氨酸水解酶ABHD12的基因。虽然ABHD12在PHARC中所起的作用已被了解，但ABHD12的全面生化特征尚不清楚。在此，我们报道了不同链长和不饱和度的单-1-（脂肪）酰基甘油脂类的简易合成，并使用该脂类底物库对重组哺乳动物ABHD12进行生化表征。ABHD12的底物分析研究表明，这种酶需要糖基化才能获得最佳活性，并且它对非常长链的脂质底物有强烈的偏好。我们针对WT和ABHD12基因敲除小鼠产生的脑膜裂解物进一步验证了该底物谱。最后，利用细胞器分馏和免疫荧光分析，我们发现哺乳动物ABHD12在内质网膜上富集，其中大多数超长链脂肪酸在细胞中生物合成。综上所述，我们的研究结果为为什么超长链脂质（如溶血磷脂酰丝氨酸脂质）在ABHD12基因敲除小鼠（PHARC小鼠模型）的大脑中积聚提供了生化解释。

关键词：ABHD12；Michaelis–Menten；PHARC；酶动力学；水解酶；脂肪酶；神经退行性疾病；亚细胞分离；超长链脂质。

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数字

图1。
图1。
这个在体外底物和哺乳动物ABHD12催化的脂肪酶反应。在每种情况下，ABHD12都会释放游离脂肪酸(金融流量账户)它水解的脂类底物产物。对于溶血磷脂，另一种产品是甘油磷酸丝氨酸(全球定位系统)，而对于1-MAG和2-MAG，另一种产物是甘油。
图2。
图2。
生成1-MAG脂质的简易合成路线。采用两步合成法生成1-MAG脂质。第一步是EDC偶联反应，将感兴趣的脂肪酸酯化为受保护的甘油部分，第二步是使用Amberlyst催化剂的脱保护反应，以产生1-MAG脂质。图中列出了每个反应的相应产率。
图3。
图3。
最佳的hABHD12活性需要糖基化。 一个通过对转染WT或S246A hABHD12的HEK293T的膜裂解物进行基于凝胶的ABPP分析，证实了WT hABHD 12的活性，而不是S246A h ABHD12。Western blotting分析证实了WT和S246A hABHD12的模拟表达。在这些实验中，GAPDH被用作负载控制。本实验以生物三份进行，结果可重复。B，PNGase F处理通过基于凝胶的ABPP和Western blotting分析证实了过度表达的WT-hABHD12的糖基化（迁移到低分子量带）。对于基于凝胶的ABPP测定，用FP罗丹明（2μ米，1 h，37°C），使用洗涤剂和加热变性，然后用PNGase F（0.01单位/μg蛋白质组）（或DPBS）处理，凝胶内荧光用作WT hABHD12的读数。本实验以生物三份进行，结果可重复。C，PNGase F的脱糖基化导致hABHD12的脂肪酶活性丧失。用洗涤剂（0.1%（w/v）Nonide P-40）或洗涤剂+PNGase F（0.1%）Nonidet P-40+0.1单位/μg蛋白质组）处理重组WT hABHD12，并根据C18:1 lyso-PS和C18:1 1-MAG底物（100μ米每个基底）。PNGase F处理的WT hABHD12对这两种底物几乎没有脂肪酶活性，与模拟和S246A hABHD12-膜裂解物对照相比。数据表示每组三个生物重复的平均值±S.D。
图4。
图4。
WT-hABHD12脂肪酶活性测定方法的优化。 一个WT-hABHD12转染HEK293T膜裂解液的脂肪酶活性随裂解液浓度（0-50μg）呈线性变化。BWT-hABHD12转染HEK293T膜裂解物（20μg）的脂肪酶活性随检测时间（0-1h）呈线性变化。在100μ米根据“实验程序”中描述的脂肪酶分析方案，每个底物的浓度。数据表示每组四个生物复制品的平均值±S.D。
图5。
图5。
重组hABHD12的酶动力学研究。不同链长的饱和1-MAG脂质对hABHD12的酶动力学分析(一个)和C18:1含有lyso-PS、1-MAG和2-MAG底物(B). 中显示的数据一个表明hABHD12对VLC 1-MAG脂质有强烈偏好，而B结果表明，hABHD12的底物偏好性为lyso-PS>1-MAG>2-MAG。用模拟或WT-hABHD12转染HEK293T细胞的膜裂解物进行检测。从WT hABHD12膜裂解物速率中减去模拟膜裂解物背景酶速率，得出hABHD12-酶速率的校正值，该值在酶动力学图中表示。每个浓度代表从三个生物复制中计算的速率。数据绘制为每个浓度的平均值±S.D线连接这些点表示符合经典的迈克尔斯-曼滕酶动力学方程。
图6。
图6。
用内源性小鼠脑ABHD12。 一个用凝胶ABPP和Western blotting分析分别确认WT（+/+）和ABHD12基因敲除（−/-）小鼠脑膜制剂的膜裂解物中ABHD12活性和表达的缺失。作为加载控制，使用GAPDH。本实验是以生物三倍体进行的，结果可重复。B用1μ米分别对JZL184和KT195进行1-MAG脂质库（100μ米每个1-MAG基板的）。数据表示每组三个生物重复的平均值±S.D。
图7。
图7。
细胞器分离和免疫荧光证实哺乳动物ABHD12的内质网定位。 一个和B，细胞器部分研究显示哺乳动物ABHD12在小鼠大脑中的微粒体富集(一个)和Neuro-2a细胞(B). 所有细胞分馏实验均至少以生物三倍进行，结果可重复。CNeuro-2a细胞的高分辨率细胞免疫荧光研究表明，ABHD12与ER标记物SEC61A有很强的共定位作用(黄色的在合并图像中）。D类，对WT（+/+）和ABHD12基因敲除（−/-）小鼠初级腹腔巨噬细胞的细胞免疫荧光研究表明，ABHD12在WT小鼠中与ER标记物KDEL有很强的共定位作用(黄色的（+/+）面板中的合并图像）和敲除小鼠中ABHD12表达缺失（无绿色（−/−）面板中的荧光）。所有细胞免疫荧光实验均在至少四个生物复制品中进行，结果可重复。
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