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。2018年8月23日；9(1):3390.
doi:10.1038/s41467-018-05906-x。

利用肿瘤微环境激活的纳米系统重建星状细胞逆转胰腺结缔组织增生

韩雪香 1 2 三, 李毅业 4 5, 应旭 1 2, 小赵 1 2, 张银龙 1 2, 肖扬 1 2, 王永伟 6, 赵瑞芳 1 2, 格雷戈里·安德森 7, 赵玉良 8 9, 聂光军 10 11
附属公司

利用肿瘤微环境激活的纳米系统重建星状细胞逆转胰腺结缔组织增生

韩雪香等。 国家公社。 。

摘要

胰腺导管腺癌的特征是由基质细胞和细胞外基质（ECM）组成的致密结缔组织增生性基质。这种屏障严重影响药物的传递和渗透。活化的胰腺星状细胞（PSC）在建立这种独特的病理障碍中起着关键作用，但也为抗肿瘤治疗提供了潜在的靶点。在这里，我们基于聚乙二醇化聚乙烯亚胺包覆的金纳米粒子构建了一个肿瘤微环境响应纳米系统，并利用它共同传递全反式维甲酸（ATRA，PSC静止的诱导剂）和靶向热休克蛋白47（HSP47，一种胶原蛋白特异性分子伴侣）的siRNA，以重新还原PSC。纳米系统同时诱导PSC静止并抑制ECM增生，从而促进药物向胰腺肿瘤的传递并显著增强化疗药物的抗肿瘤疗效。我们通过靶向激活的PSC来恢复同向性基质功能的组合策略是一种很有希望的方法，可以提高化疗和其他治疗方式对多种富含基质的肿瘤的疗效。

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图1
图1
胰腺促结缔组织增生间质的同向性修复方案。一基于pH-responsive金纳米粒子的ATRA和HSP47 siRNA共递送系统的制造示意图。阴离子ATRA和siRNA被静电吸附到“可脱落”PEG接枝聚乙烯亚胺（PEI）包覆的金纳米粒子上。b条纳米系统对PSC的再教育和基质调制示意图。纳米系统在酸性胰腺肿瘤微环境（pHe~6.5）中被“激活”（PEG脱落、尺寸减小、电荷增加和疏水配体暴露），并在PSC中表现出pHe和ATRA双重增强的细胞摄取和HSP47击倒。因此，活化的PSCs恢复为静止表型，促结缔组织增生性基质恢复为均质状态，血液灌注和药物输送得到改善
图2
图2
特征金@聚丙烯/RA/siRNA纳米系统。一基于AuNP的纳米系统的典型TEM图像。比例尺，100 纳米。插图，放大的显微照片。比例尺，10 纳米。b条所示纳米系统和ATRA的紫外-可见吸收光谱。插图，所示纳米系统样品的照片。c（c）用动态光散射（DLS）测量纳米系统的尺寸分布。d日10个纳米系统的Zeta电位 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).e（电子）在Au与siRNA的不同w/w比率下，对siRNA进行琼脂糖凝胶电泳延迟分析。两个纳米系统的w/w比均为7.5时，siRNA完全延迟。（f）RNase A处理2个不同纳米系统的siRNA保护试验 在pH 7.4或6.5下。与未经处理的4号车道相比(金@聚丙烯/未经RNase A处理的siRNA，设为100%），RNase A处理后，5-9通道的剩余siRNA数量分别为81%、77%、84%、77和60%
图3
图3
pHe和ATRA双重增强细胞摄取和基因沉默。一负载Cy5-siRNA-的PSCs孵育后的流式细胞术分析金@聚丙烯或金@聚丙烯/RA在pH 7.4或6.5下2次 小时。b条不同组的平均荧光强度（MFI）。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）。c（c）在pH 7.4或6.5的条件下，将负载Cy5-siRNA（红色）的配方培养2小时后，PSC的共焦激光扫描显微镜图像 h.F-actin用指骨样蛋白（绿色）标记，细胞核用Hoechst 33342（蓝色）标记。比例尺，20 微米。d日48例PSC患者使用指定配方治疗后HSP47蛋白的Western blot分析 pH值为7.4或6.5时为h。Lipofectamine 2000转染剂作为阳性对照（Lipo2000/siHSP47）。符号。C、 阴性对照siRNA；siHSP47、HSP47 siRNA。e（电子）定量分析正常化HSP47蛋白表达（使用Image J软件）。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图4
图4
体外逆转活化的PSCs和ECM减少。一HSP47的免疫荧光（IF）染色、脂滴的尼罗红染色、α-SMA的IF染色、沉积胶原蛋白的天狼星红染色和用所示配方治疗48例PSC后的纤维连接蛋白IF染色 pH值6.5时为h。比例尺，20 微米。b条定量正常化HSP47蛋白表达（使用Image J软件）。c（c）定量正常化α-SMA蛋白表达（使用Image J软件）。d日通过在540℃下测量提取的天狼星红染料，将沉积的胶原蛋白归一化 纳米。e（电子）正常化纤连蛋白表达的定量（使用ImageJ软件）。（f）用所示配方治疗48天后，对PSCs培养上清液中分泌的I型胶原和全细胞裂解液中的纤维连接蛋白进行Western blot分析 pH值6.5时为h。克定量分析正常化的纤维连接蛋白和I型胶原蛋白表达（使用Image J软件）。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).*对 < 0.05时，**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图5
图5
小分子在Panc-1/PSC富基质球体（PDAC-SS）中的渗透。PDAC-SS由PSCs（用不同配方预处理）和Panc-1细胞的悬滴培养产生。一PDAC-SS的典型亮场图像、天狼星红染色图像、纤维连接蛋白免疫荧光图像和穿透Hoechst 33342荧光图像。比例尺，100 微米。b条–d日正常化胶原阳性（天狼星红染色）区域的量化(b条)，纤维连接蛋白表达(c（c）)和Hoechst 33342的穿透深度（d；使用Image J软件）。采用低分子量荧光DNA结合染料Hoechst 33342作为探针，观察PDAC-SS的渗透性。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).*对 < 0.05时，**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图6
图6
药物动力学和生物分布金@聚丙烯/体内RA/siRNA。一药物动力学曲线金@聚丙烯/siRNA和金@聚丙烯/使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）通过血液中的Au含量分析RA/siRNA，显示为注射剂量的百分比（%ID）。b条生物分布金@聚丙烯/siRNA和金@聚丙烯/24时使用ICP-MS通过Au含量分析的RA/siRNA 注射后h，表示为每克组织注射剂量的百分比（%ID/g）。c（c）24岁时典型肿瘤的体外荧光图像 注射Cy5-siRNA后h，金@聚丙烯/Cy5-siRNA和金@聚丙烯/RA/Cy5-siRNA。d日肿瘤中平均荧光信号强度的定量分析。e（电子）Cy5-siRNA的分布，金@聚丙烯/Cy5-siRNA和金@聚丙烯/24岁时肿瘤中的RA/Cy5-siRNA h注射后。血管用CD31（绿色）染色，细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺，50 微米。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图7
图7
Panc-1/PSC皮下异种移植物的基质调节。一基质调制的不同治疗配方方案。通过在BALB/c裸鼠体内联合接种Panc-1和PSCs建立胰腺促结缔组织增生皮下异种移植。各种配方（ATRA:2.4 毫克/千克；小干扰RNA：0.97 mg/kg），每2天静脉注射三次。b条治疗期间小鼠体重的变化。c（c）治疗期间肿瘤生长曲线。d日肿瘤中HSP47蛋白的Western blot分析。e（电子）肿瘤中正常HSP47蛋白表达的定量分析（使用Image J软件）。（f）肿瘤切片的H&E组织学研究、胶原三色染色、HSP47和纤维连接蛋白免疫组化染色。比例尺，50 微米。克–我归一化HSP47的定量分析(克)、胶原蛋白(小时)和纤连蛋白(我)蛋白质水平（使用Image J软件）。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).*对 < 0.05时，**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图8
图8
Panc-1/PSC皮下异种移植物的联合治疗。一联合治疗方案。胰腺肿瘤小鼠接受金@聚丙烯/RA/siHSP47每2天静脉注射三次，随后每2天接受吉西他滨静脉注射五次。b条治疗期间小鼠体重的变化。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 5).c（c）治疗期间肿瘤生长曲线。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 5). 使用Mann–Whitney分析平均肿瘤体积U型测试。**对 < 0.01,***对 < 0.001.d日切除肿瘤的图像。e（电子）治疗后的肿瘤重量。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 5).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）。（f）肿瘤切片中增殖细胞核抗原（PCNA）的H&E和免疫组织化学染色的组织学研究。比例尺，50 微米。克PCNA阳性肿瘤细胞的定量。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 5).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
图9
图9
Panc-1-luci/PSC原位异种移植物的联合治疗。一联合治疗方案。通过将表达荧光素酶的Panc-1细胞（Panc-1-luci）和PSCs共同接种到BALB/c裸鼠的胰腺尾部来建立促结缔组织增生性胰腺原位异种移植物。老鼠收到金@聚丙烯/RA/siHSP47每2天静脉注射三次，随后每2天接受吉西他滨静脉注射五次。b条治疗期间小鼠体重的变化。c（c）第15、18、21、26和31天小鼠的体内全身生物发光图像。d日通过体内生物发光信号的定量分析确定肿瘤生长曲线。e（电子）脾脏切除肿瘤的图像。比例尺，1 厘米。（f）治疗后肿瘤重量。克用H&E和PCNA免疫组织化学染色对肿瘤切片进行组织学研究。比例尺，50 微米。小时PCNA阳性肿瘤细胞的定量。数据显示为平均值 ± 标准差(n个 = 3).**对 < 0.01,***对 < 0.001（学生的t吨测试）
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参考文献

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