Armadillo repeat containing 12 promotes neuroblastoma progression through interaction with retinoblastoma binding protein 4

doi:10.1038/s41467-018-05286-2

.2018年7月19日；9(1):2829.

doi:10.1038/s41467-018-05286-2。

含12的犰狳重复序列通过与视网膜母细胞瘤结合蛋白4的相互作用促进神经母细胞瘤进展

附属公司

¹中华人民共和国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院小儿外科，邮编：430022。
²中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院病理科，邮编：430022。
^三中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。
⁴中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院病理科，邮编：430022。ld_zheng@hotmail.com。
⁵中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。ld_zheng@hotmail.com。
⁶中华人民共和国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院小儿外科，邮编：430022。qs_tong@hotmail.com。
⁷中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。qs_tong@hotmail.com。

PMID： 30026490
预防性维修识别码： PMC6053364型
DOI（操作界面）： 10.1038/s41467-018-05286-2

含12的犰狳重复序列通过与视网膜母细胞瘤结合蛋白4的相互作用促进神经母细胞瘤进展

李丹（Dan Li）等。国家公社. 2018.

.2018年7月19日；9(1):2829.

doi:10.1038/s41467-018-05286-2。

作者

附属公司

¹中华人民共和国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院小儿外科，邮编：430022。
²中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院病理科，邮编：430022。
^三中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。
⁴中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院病理科，邮编：430022。ld_zheng@hotmail.com。
⁵中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。ld_zheng@hotmail.com。
⁶中华人民共和国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院小儿外科，邮编：430022。qs_tong@hotmail.com。
⁷中国湖北省武汉市解放大道1277号华中科技大学同济医学院联合医院人类基因组研究临床中心，邮编430022。qs_tong@hotmail.com。

PMID： 30026490
预防性维修识别码：下午6055364
DOI（操作界面）： 10.1038/s41467-018-05286-2

摘要

最近的研究表明犰狳（ARM）家族蛋白在肿瘤进展中的新作用。然而，ARM成员在神经母细胞瘤（NB）的肿瘤发生和侵袭性中的功能和潜在机制仍有待确定。在此，我们确定包含12（ARMC12）的犰狳重复序列是与NB进展相关的ARM成员。ARMC12促进NB细胞系的生长和侵袭性。从机制上讲，ARMC12与视网膜母细胞瘤结合蛋白4（RBBP4）发生物理相互作用，促进多梳抑制复合物2的形成和活性，从而导致肿瘤抑制基因的转录抑制。通过细胞穿透抑制肽阻断ARMC12和RBBP4之间的相互作用，激活下游基因表达，抑制NB细胞的肿瘤发生和侵袭性。ARMC12和RBBP4在NB组织中均上调，并与患者的不良预后相关。这些发现表明ARMC12在肿瘤进展中起着关键作用，并为NB提供了潜在的治疗途径。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
的标识*ARMC12系列*作为与NB进展相关联的ARM成员。一维恩图（左面板）和热图（右面板）揭示了与NB不良预后相关的升高基因的识别(*P（P）* < 0.01，未配对双面t吨测试，FDR < 0.05）使用神经嵴（NC，GSE14340）和88例NB病例（GSE16476）的公共数据集，这些病例具有不同的死亡状态、进展和INSS分期。b条Kaplan−Meier曲线表明88人存活（GSE16476，截止值 = 31.1）和498（GSE62564，截止值 = 4.371）NB患者高或低*ARMC12系列*表达式。**c（c）**基因集富集分析*ARMC12系列*-来自公开数据集（GSE16476）的88个NB组织中的相关基因。NES标准化浓缩分数。标称值归一化。d日挖掘公共数据集（GSE14340和GSE16476），揭示*ARMC12系列*北卡罗来纳州成绩单(n个 = 5）和NB纸巾(n个 = 88）具有不同的死亡状态、进展和INSS阶段。**e（电子）**代表性免疫组织化学染色（左上下面板）显示ARMC12在NB标本肿瘤细胞中的表达（箭头，棕色）。比例尺：100 微米。42例ARMC12免疫染色高或低的NB患者的Kaplan-Meier生存曲线（右下面板）。**（f）**蛋白质印迹（上图）和实时qRT-PCR（下图，标准化为GAPDH）表明*ARMC12系列*正常背神经节（DG，n个 = 21）、NB组织(n个 = 42）和培养的NB细胞系(n个 = 每个细胞系6个），带[NB-1643、SK-N-BE（2）、NB-1691、IMR32、BE（2）-C]或不带*MYCN公司*扩增（SK-N-AS、SH-SY5Y、SK-N-SH）。重叠分析的Fisher精确检验一; 对数秩检验b条和**e（电子）**; 未配对双面t吨在中测试d日; 采用Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析**（f）**条是指平均值和胡须（最小到最大）英寸d日数据显示为平均值 ± s.e.m.（误差棒）和三个独立实验的代表**（f）**

图2
*ARMC12系列*促进体外和体内NB细胞的生长和侵袭性。一,b条Western blot分析显示ARMC12在稳定转染空载体（mock）的NB细胞中的表达，*ARMC12系列*、扰乱shRNA（sh-Scb）或sh-ARMC12。**c（c）**MTT比色分析法描述了稳定转染模拟物的NB细胞的细胞活力变化，*ARMC12系列*、sh-Scb或sh-ARMC12(n个 = 每个时间点6个）。d日软琼脂分析的代表性图像（左面板）和量化（右面板）显示了稳定转染模拟物的NB细胞的锚定非依赖性生长，*ARMC12系列*、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组4个）。**e（电子）**基质凝胶侵袭试验的代表性图像（左面板）和量化（右面板）显示了稳定转染模拟物的NB细胞的侵袭能力，*ARMC12系列*、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组4个）。**（f）**皮下注射稳定转染模拟细胞的SH-SY5Y和BE（2）-C细胞形成的异种移植物的代表性图像（上面板）、体内生长曲线（左下面板）和终点重量（右下面板），*ARMC12系列*、sh-Scb或sh-ARMC12#1进入裸鼠背侧(n个 = 每组5人）。克尾静脉注射SH-SY5Y和BE（2）-C细胞稳定转染模拟细胞治疗的裸鼠肺转移定植和Kaplan−Meier曲线的代表性图像（上面板）和量化（中面板），*手臂12*、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组5人）**P（P）* < 0.01 vs.模拟或sh-Scb。年Bonferroni多重比较试验的单向方差分析**c（c）**; 未配对双面t吨在中测试**c−g**; 生存率比较的log-rank检验克.NS，不显著。数据显示为平均值 ± s.e.m.（误差棒）和三个独立实验的代表一−**e（电子）**

图3
在NB细胞中，ARMC12与RBBP4蛋白相互作用。一Co-IP、康马西蓝染色（左面板）和质谱（MS）分析（右面板）显示了用空载体（模拟）或*ARMC12系列*.b条Co-IP和western blot分析表明BE（2）-C和IMR32细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的内源性相互作用。免疫球蛋白G（IgG）结合蛋白作为阴性对照。**c（c）**Co-IP和western blot分析（下面板）描述了转染模拟FLAG标记的SH-SY5Y细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的相互作用*ARMC12系列*截断（上部面板）和HA-tagedRBBP4型.d日Co-IP和western blot分析（下表）显示了ARMC12和RBBP4蛋白在转染模拟、HA-tagg的SH-SY5Y细胞中的相互作用*RBBP4型*截断（上面板），并标记FLAGARMC12系列.e（电子）,**（f）**Co-IP和western印迹(**e（电子）**、中间和右侧面板）和BiFC(**（f）**，箭头）检测表明野生型或突变型转染SH-SY5Y细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的相互作用(**e（电子）**，左侧面板）标记了FLAGARMC12系列和HA-标记*RBBP4型*.比例尺：10 微米。数据代表三个独立实验

图4
*ARMC12系列*促进PRC2复合物的形成和EZH2活性。一,b条Co-IP和western blot表明ARMC12与空载体稳定转染的SH-SY5Y和BE（2）-C细胞中RBBP4、EZH2或SUZ12的相互作用（模拟），*ARMC12系列*、加扰shRNA（sh-Scb）或sh-ARMC12#1。**c（c）**Co-IP和western blot显示稳定转染sh-Scb或sh-RBBP4#2的BE（2）-C细胞中ARMC12与RBBP4、EZH2或SUZ12的相互作用。d日Co-IP和western blot表明稳定转染sh-Scb、sh-RBBP4#2、sh-EZH2#1或sh-SUZ12#1的BE（2）-C细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。**e（电子）**免疫荧光共聚焦图像显示稳定转染sh-Scb、sh-RBBP4#2、sh-EZH2#1或sh-SUZ12#1的BE（2）-C细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。比例尺：10 微米。**（f）**Western blot（上面板）和化学发光分析（下面板，n个 = 4个/组），表明稳定转染模拟物的NB细胞中的H3K27me3水平和EZH2活性，*手臂12*,*RBBP4型*,*EZH2型*、sh-Scb、sh-ARMC12#1、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1**P（P）* < 0.01与模拟 + sh-Scb（未配对双面t吨测试中的两组**（f）**). 数据显示为平均值 ± 误差棒和三个独立实验的代表

图5
异位表达*ARMC12系列*抑制NB细胞中PRC2下游抑癌基因的表达。一火山图（左面板）、维恩图（中面板）和热图（右面板）揭示了基因表达的变化（折叠变化 > 2.0，FDR < 0.05）在稳定转染空载体（模拟）或*ARMC12系列*。红色表示高表达，蓝色表示热图中低表达。b条ChIP和qPCR表明ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3（归一化为输入）在SH-SY5Y细胞中稳定转染模拟或*ARMC12系列*以及与干扰shRNA（sh-Scb）、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1共同转染的(n个 = 每组5人）。**c（c）**,d日实时qRT-PCR(**c（c）**,n个 = 每组5个）和western blot(d日)显示稳定转染模拟或*手臂12*以及与sh-Scb、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1共同转染的**P（P）* < 0.01与模拟 + sh-Scb型。重叠分析的Fisher精确检验一; 未配对双面t吨测试中的两组b条和**c（c）**数据显示为平均值 ± s.e.m.（误差棒）和三个独立实验的代表b条−d日

图6
击倒*手臂12*增加NB细胞中PRC2下游抑癌基因的表达。一ChIP和qPCR表明ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3（归一化为输入）在稳定转染shRNA（sh-Scb）或sh-ARMC12#1的BE（2）-C细胞中的靶基因启动子上富集，以及那些与*RBBP4型*或*EZH2型*(n个 = 每组5人）。b条,**c（c）**实时qRT-PCR(b条,n个 = 每组5个）和western blot(**c（c）**)显示稳定转染sh-Scb或sh-ARMC12#1的BE（2）-C细胞中目标基因（标准化为GAPDH）的转录物和蛋白质水平的分析，以及与*RBBP4型*或*EZH2型*. **P（P）* < 0.01 vs.sh-Scb + 模拟（未配对双面t吨测试中的两组一和b条). 数据显示为平均值 ± 误差棒和三个独立实验的代表

图7
抑制肽阻断NB细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。一预测阻断ARMC12和RBBP4相互作用的抑制肽的结构和序列。b条共焦图像显示合成的抑制肽在培养的BE（2）-C细胞中的分布。比例尺：10 微米。**c（c）**生物素标记肽下拉和western blot分析表明抑制肽（50 μmol（摩尔） L（左）⁻¹)细胞裂解物中的RBBP4蛋白。d日Co-IP和蛋白质印迹揭示了用不同剂量的对照或抑制（RBP23）肽处理24小时的NB细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用 h、或50 μmol（摩尔） L（左）⁻¹对照肽或RBP23用于所指示的时间点。**e（电子）**ChIP和qPCR显示ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3（归一化为输入）在SH-SY5Y细胞中稳定转染模拟或*ARMC12系列*以及用抑制肽RBP23（50 μmol（摩尔） L（左）⁻¹)24小时小时(n个 = 每组5人）。**（f）**,克实时qRT-PCR(**（f）**,n个 = 每组5个）和western blot(克)指示SH-SY5Y细胞和SK-N-SH中靶基因（归一化为GAPDH）的表达*ARMC12系列*以及用抑制肽RBP23（50 μmol（摩尔） L（左）⁻¹)24小时小时**P（P）* < 0.01与模拟 + 控制（未配对双面t吨测试中的两组**e（电子）**和**（f）**). 数据显示为平均值 ± 误差棒和三个独立实验的代表

图8
抑制肽在体内外抑制NB细胞的肿瘤发生和侵袭性。一MTT比色法描述了NB细胞、非转化MCF 10A细胞和转化的HEK293细胞经不同剂量的对照或抑制（RBP23）肽处理24小时后生存能力的变化 h、或50 μmol（摩尔） L（左）⁻¹所示时间点的控制肽或RBP23(n个 = 每组6个）。b条,**c（c）**软琼脂的代表性图像（左侧面板）和量化（右侧面板）(b条)和transwell基质凝胶入侵(**c（c）**)用对照肽或RBP23（10 μmol（摩尔） L（左）⁻¹)24小时小时(n个 = 每组4个）。d日裸鼠皮下注射BE（2）-C细胞形成的异种移植物的体内生长曲线（左下面板）、代表性图像（中上面板）、终点肿瘤重量（中下面板）和western blot检测的基因表达（右面板）(n个 = 5个/组），随后通过瘤内注射控制肽或RBP23（3 毫克公斤⁻¹)如图所示（左上面板）。**e（电子）**裸鼠肺转移定植和Kaplan−Meier曲线的代表性图像（左面板）和量化（中面板）(n个 = 每组5个），用尾静脉注射BE（2）-C细胞并随后给予对照肽或RBP23（3 毫克公斤⁻¹)如图所示。比例尺：100 μm**P（P）* < 0.01与对照组。未配对双面t吨在中测试**a−e**; 对数秩检验**e（电子）**.NS，不显著。数据显示为平均值 ± s.e.m.（误差棒）和三个独立实验的代表一−**c（c）**

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