Intravital microscopy of collective invasion plasticity in breast cancer

doi:10.1242/dmm.034330

.2018年8月23日；11（9）：dmm034330。

doi:10.1242/dmm.034330。

乳腺癌集体浸润可塑性的活体显微镜观察

奥尔加·伊琳娜¹, 伦纳德·坎帕内洛², 帕夫洛·格里森科¹, 马农·武林斯（Manon Vullings）¹, 王晨露², 彼得·布尔特^三, 沃尔夫冈·洛塞特², 弗里德^4 5 6

附属公司

¹荷兰奈梅亨，Radboud大学医学中心，Radbound分子生命科学研究所，细胞生物学系，邮政信箱9101，6500HB。
²美国马里兰州帕克学院马里兰大学物理科学与技术研究所物理系，邮编：20742。
^三荷兰奈梅亨Radboud大学医学中心病理学系，邮政信箱9101，6500HB。
⁴荷兰奈梅亨，Radboud大学医学中心，Radbound分子生命科学研究所，细胞生物学系，邮政信箱9101，6500HBpeter.friedl@radboudumc.nl。
⁵荷兰乌得勒支3584CG癌症基因组中心。
⁶David H.Koch泌尿生殖系肿瘤应用研究中心，德克萨斯大学MD Anderson癌症中心，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。

PMID： 29997220
预防性维修识别码：项目经理6176993
内政部： 10.1242/dmm.034330

乳腺癌集体浸润可塑性的活体显微镜观察

奥尔加·伊琳娜等。 Dis模型机械. 2018.

.2018年8月23日；11（9）：dmm034330。

doi:10.1242/dmm.034330。

作者

奥尔加·伊琳娜¹, 伦纳德·坎帕内洛², 帕夫洛·格里森科¹, 马农·武林斯（Manon Vullings）¹, 王晨露², 彼得·布尔特^三, 沃尔夫冈·洛塞特², 弗里德^4 5 6

附属公司

¹荷兰奈梅亨，Radboud大学医学中心，Radbound分子生命科学研究所，细胞生物学系，邮政信箱9101，6500HB。
²美国马里兰州帕克学院马里兰大学物理科学与技术研究所物理系，邮编：20742。
^三荷兰奈梅亨Radboud大学医学中心病理学系，邮政信箱9101，6500HB。
⁴荷兰奈梅亨，Radboud大学医学中心，Radbound分子生命科学研究所，细胞生物学系，邮政信箱9101，6500HBpeter.friedl@radboudumc.nl。
⁵荷兰乌得勒支3584CG癌症基因组中心。
⁶David H.Koch泌尿生殖系肿瘤应用研究中心，德克萨斯大学MD Anderson癌症中心，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。

PMID： 29997220
预防性维修识别码：项目经理6176993
内政部： 10.1242/dmm.034330

摘要

癌症侵袭计划通过在转移性集体传播和单细胞传播之间切换来适应；然而，目前小鼠上皮癌的活体显微镜模型未能可靠地再现这种侵袭可塑性。通过将乳腺癌球体微植入小鼠乳腺脂肪垫并进行活细胞监测，我们显示了从集体细胞向单细胞过渡期间的微环境条件和细胞骨架适应体内E-cadherin表达的4T1和E-cadherin-negated MMT肿瘤均沿基质结构开始集体浸润，反映了3D器官型培养和人类原发性导管和小叶癌的浸润模式。共同入侵的细胞发展出弱振荡的肌动蛋白动力学，但为单个细胞转变提供了区域，肌动蛋白波动更为明显、更为混乱。这表明集体入侵体内作为单细胞释放的动态生态位和有效来源。

关键词：肌动蛋白动力学；肿瘤侵袭；活体显微镜检查。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

**图1。**
**用于监测组织浸润和随后转移形成的乳腺成像模型。**（A）球形植入乳腺脂肪垫并随后检测转移的实验设计示意图。描述了乳腺脂肪垫内的主要侵入导向组织结构。图中还显示了一张手术后安装了一个定制的活体显微镜支架的小鼠图像。（B）Z轴-球体植入前显示乳腺脂肪垫组织结构的图像叠加（上排）。Z轴-MMT肿瘤球体植入乳腺脂肪垫后的图像叠加（下一行）。显示每个图像的图像深度。（C）通过全身荧光成像监测多灶肿瘤生长，并量化多灶MMT肿瘤生长。数据代表6只小鼠，每只小鼠有7-9个肿瘤。方框图显示中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。*P（P）*-值通过Mann-Whitney检验获得。（D）小鼠肺部的宏观和微观转移2-3 4T1（上排）或MMT（下排）肿瘤植入乳腺脂肪垫后周。箭头表示癌细胞簇。支气管；BV，血管；M、转移。（E）每个肺切片的多细胞转移灶频率。4T1和MMT转移簇的最小大小被认为是≥3个细胞。平均每个肺分析74-85（4T1）和85-124（MMT）片。在6只（MMT）小鼠中有5只和10只（4T1）小鼠中7只检测到转移簇。方框图显示了6只（MMT）和10只（4T1）小鼠的中位数（黑线）、25%/75%（方框）和最大/最小值（胡须）。*P（P）*-值通过Mann-Whitney检验获得。比例尺：50 微米（B）；2 毫米（C）；200 μm（D，左栏），50 μm（D、中柱和右柱）。

**图2。**
**乳腺肿瘤成像模型中的集体和个体细胞侵袭模式和血管生成。**（A）通过2光子显微镜监测4T1（上排）和MMT（下排）肿瘤生长和血管生成的时间过程。概述图像是单独图像的蒙太奇，表示*z（z）*-用5获得堆栈 µm间隔。点线框显示了集体入侵链和单个细胞的特写镜头。箭头表示单个单元格。（B）乳腺脂肪垫4中4T1（左）和MMT（右）细胞的集体侵袭球体植入后第天。水平（XY）和正交（XZ）投影*z（z）*-堆栈。虚线标记正交视图的横截面平面的位置。箭头表示Lifeact-eGFP沿细胞-细胞连接处富集。（C）每个肿瘤的集体入侵链数、集体入侵链的长度和每个肿瘤的单独入侵细胞数。集合链被确定为从多细胞球体径向突出的连接肿瘤细胞群（基于GFP或DsRed2信号）。细胞-细胞接触被检测为核H2B-eGFP信号，Lifeact-eGFP沿细胞-细胞边界（4T1）或连续DsRed2信号（MMTz（z）-堆栈。数据表示每个细胞系4只小鼠的7-12个肿瘤中的9-16条集合链和9-10个单细胞。（D）血管网面积归一化为肿瘤面积。数据表示每个细胞系4只小鼠的4-11个肿瘤。C和D中的方框图显示了中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。*P（P）*-值通过Mann-Whitney检验获得。比例尺：200 μm（A，概述）；25 μm（A，右侧虚线框中放大的区域）；50 微米（B）。

**图3。**
**植入性乳腺肿瘤和患者样本的基质重塑**（A）表示4T1球体植入（上排）后和8天后小鼠乳腺脂肪垫中基质成分的示例图像天（中排），与人类浸润性导管癌（IDC）病变（下排）相比。箭头表示波形蛋白阳性的成纤维细胞。（B）瘤周基质中波形蛋白阳性基质细胞的数量。每组数据代表来自3只小鼠和4个独立人类IDC样本的5个肿瘤。B中的方框图显示中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。*P（P）*-值通过Mann-Whitney检验获得。（C） 4T1（上排）和MMT（中排）细胞的集体和单细胞侵袭4 与人类IDC（下排）侵犯富含胶原蛋白的基质和脂肪组织相比，球体植入后第天。（D）肿瘤细胞沿胶原纤维排列的分析原理（左）和定量（右）。4T1和MMT肿瘤中的细胞和胶原纤维4 球状体植入后第天和人类IDC被确定，如C所示。细胞相对于胶原纤维排列的量化，以0±25°扇区内的分数表示。数据代表34条（4T1）和21条（MMT）集合链，21条（4T1）和17条（MMT）单细胞，每个细胞系来自3只小鼠的8个肿瘤，以及来自5个独立人类IDC样本的35条集合链。B和D中的方框图显示中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。*P（P）*-值通过Mann-Whitney检验获得。比例尺：50 微米。

**图4。**
**集体和单细胞侵袭期间的肌动蛋白动力学。**每个细胞的时间依赖性形状由连续的单个成像平面导出，并通过半自动形状分析提取，沿着细胞边缘的Lifeact-eGFP强度由相等的片段获得2.07 从边界向内µm。（A）不同侵袭部位的4T1细胞体内4 植入后天。将分割的细胞分为分离细胞（1）、尖端细胞（2）和体积细胞（3），并计算、标记和跟踪边界点的拓扑结构，以进行肌动蛋白强度的时间依赖性分析。（B）每个边界点截面的平均肌动蛋白强度随时间变化的Kymograph。（C）侵入细胞中肌动蛋白的波动。左：肌动蛋白强度的延迟自相关，从B中所示的分离细胞示例中导出（黑线表示平均值，灰色区域表示标准偏差）。中间：分离（1）、尖端（2）和大块（3）细胞肌动蛋白强度的聚合延迟自相关曲线，分别表示为来自3个独立肿瘤的4、8和15个细胞的平均值（黑线）和标准偏差（阴影区）。右：间隔10的强度变化 s（代表快速波动）和60 s（缓慢波动）。在比较分离细胞和体积细胞之间的平均变异性时发现存在显著差异。（D）从分离（1）、尖端（2）和大块（3）细胞的延时序列中获得的细胞边界运动轨迹及其边界运动分布。尽管肌动蛋白强度变异性存在差异，但每组细胞都表现出相似的背景行为，分离细胞和尖端细胞经历大突起事件的频率高于体细胞。边界运动第50百分位和第95百分位分布的箱线图（E）进一步表明了这一趋势，尽管在平均值之间没有发现显著差异。（F） 2以上的运动百分比所示细胞亚群的µm表示分离细胞和散装细胞以及尖端细胞和散装电池之间的行为存在显著差异。C、E和F中的方框图显示了3个独立实验中每个条件下5-6个细胞的中位数（黑线）、25/75百分位数（方框）、最大值/最小值（胡须）和异常值（红十字）。*P（P）*-通过Bonferroni校正的单向方差分析和Tukey–Kramer多重比较试验获得值。比例尺：50 μm（A，概述），10 μm（A，右侧虚线框中放大的区域）。

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1. Aceto N.、Bardia A.、Miyamoto D.T.、Donaldson M.C.、Wittner B.S.、Spencer J.A.、Yu M.、Pely A.、Engstrom A.、Zhu H.等人（2014）。循环肿瘤细胞簇是乳腺癌转移的寡克隆前体。单元格1581110-1122。2016年10月10日/j.cell.2014.07.013-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
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[7] Bronsert P.、Enderle-Ammour K.、Bader M.、Timme S.、Kuehs M.、Csanadi A.、Kayser G.、Kohler I.、Bausch D.、Hoeppner J.等人（2014年）。癌细胞侵袭和EMT标记物表达：人类癌细胞-宿主界面的三维研究。《病理学杂志》。234, 410-422. 10.1002/路径4416-DOI程序-公共医学

[8] Bronsert P.、Enderle-Ammour K.、Bader M.、Timme S.、Kuehs M.、Csanadi A.、Kayser G.、Kohler I.、Bausch D.、Hoeppner J.等人（2014年）。癌细胞侵袭和EMT标记物表达：人类癌细胞-宿主界面的三维研究。《病理学杂志》。234, 410-422. 10.1002/路径4416-DOI程序-公共医学

[9] Cheung K.J.和Ewald A.J.（2016）。转移的共同途径：肿瘤细胞簇播种。《科学》352167-169。10.1126/science.aaf6546-DOI程序-公共医学

[10] Cheung K.J.和Ewald A.J.（2016）。转移的共同途径：肿瘤细胞簇播种。《科学》352167-169。10.1126/science.aaf6546-DOI程序-公共医学

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