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。2018年8月；40(2):621-634.
doi:10.3892/或.2018.6515。 Epub 2018年6月20日。

BDNF/TrkB信号转导的增殖作用与宫颈癌抗失巢凋亡相关

袁媛 1, 海琼叶 1, 钱川任 1
附属机构

BDNF/TrkB信号转导的增殖作用与宫颈癌抗失巢凋亡相关

袁媛等。 及国际医学权威期刊。 2018年8月。

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养素家族的成员之一。BDNF诱导的受体酪氨酸激酶B（TrkB）活化与许多恶性肿瘤的失巢耐受、肿瘤进展和不良预后有关。然而，据我们所知，没有报道描述BDNF/TrkB轴对宫颈癌的作用。采用免疫组织化学、western blot分析和定量PCR方法，对87例宫颈癌组织和癌旁正常组织中BDNF和TrKB的表达进行了分析，结果表明，BDNF、TrKB在癌组织中的表达分别显著高于正常癌旁组织。BDNF和TrKB在IIB或更高阶段的表达率较高，并且BDNF的表达与淋巴结转移呈正相关。值得注意的是，TrKB的高表达可能与生存时间短有关，Kaplan‑Meier分析证实了这一点。与相应的CC细胞系HeLa、SiHa、CASKI、C4‑1和C‑33a相比，BDNF和TrKB在失巢样凋亡耐受（AAT）中的表达增强，这是一种从宫颈癌细胞系建立的细胞模型。与CC细胞系相比，AAT细胞表现出更高的增殖活性，这一点得到了证实，即G0/G1期更短，cyclin a、cyclin D1和c‑myc升高，caspase‑3和Bax降低，Bcl‑2升高。相反，TrKB表达的下调逆转了AAT细胞中的这些变化，诱导G0/G1阻滞并抑制增殖活性。本研究结果表明，PI3K/Akt信号通路参与BDNF/TrKB诱导的宫颈癌AAT细胞增殖。这些发现表明BDNF/TrKB通路是宫颈癌治疗的潜在靶点。

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数字

图1。
图1。
免疫组化检测BNDF和TrKB蛋白在宫颈癌组织中的表达水平，并与生存时间呈负相关。（A-C）分别代表弱、中度和强BNDF表达。（D-F）分别代表弱、中、强TrKB表达。（G）BDNF和（H）TrKB阴性表达的患者的总生存时间延长。
图2。
图2。
与正常组织和Ect1/E6E7细胞相比，在宫颈癌组织和细胞系中分别观察到BDNF和TrKB在翻译和转录水平的过度表达。对5对癌组织和正常组织进行Western blot和RT-qPCR检测。（A和B）Western blot分析显示，宫颈癌组织中BDNF和TrKB蛋白高于相应的邻近正常组织。（C） BDNF和TrKB的相对mRNA水平高于邻近正常组织。（D和E）宫颈癌细胞系中BDNF和TrKB的蛋白水平明显高于Ect1/E6E7细胞。（F） 宫颈癌细胞系中BDNF和TrKB的相对mRNA水平显著高于Ect1/E6E7细胞*P<0.05，癌组织与正常组织或癌细胞系与Ect1/E6E7细胞。
图3。
图3。
Western blot和RT-qPCR检测显示TrKB siRNA对AAT细胞中BDNF和TrKB的表达具有下调作用。对HeLa和SiHa细胞（对照）、AAT细胞（模型）、TrKB阴性处理的AAT细胞和TrKB siRNA处理的AAT细胞进行Western blot和RT-qPCR分析。（A和B）对于来源于HeLa的AAT细胞，BDNF和TrKB的蛋白水平与相应的HeLa细胞相比增加，在TrKB siRNA处理的细胞中降低。（C）模型AAT细胞中BDNF与TrKB的相对mRNA水平与相应HeLa电池相比增加，与模型组AAT细胞相比，经TrKB siRNA处理的AAT细胞数量减少。（D和E）同样，对于来源于SiHa的AAT细胞，BDNF和TrKB的蛋白水平与相应的SiHa细胞相比增强，而在TrKB siRNA处理的细胞中则减弱，与模型组AAT细胞相比，经TrKB siRNA处理的AAT细胞的表达量减少*与对照组相比，P<0.05；#与siTrKB相比，P<0.05。
图4。
图4。
TrKB siRNA处理的细胞增殖受到抑制，凋亡被诱导。培养3天后，模型组（A）HeLa和（B）SiHa细胞的细胞活力略高于对照组。然而，与模型组第3天的细胞相比，TrKB的敲除对来自siTrKB组的（A）HeLa和（B）SiHa细胞的增殖有明显抑制作用。流式细胞仪检测细胞凋亡。与对照组、模型组和siNC组相比，经siTrKB处理的（C-F）HeLa和（G-J）SiHa细胞的凋亡率增加*与对照组相比，P<0.05；#与siTrKB相比，P<0.05。
图5。
图5。
沉默TrKB在HeLa和SiHa细胞衍生的AAT细胞中诱导G0/G1阻滞。用流式细胞术测定HeLa细胞中不同组（对照组、模型组、siNC组和siTrKB组）的细胞周期。（E） 不同组之间的细胞周期比较表明，与相应的HeLa细胞（对照）相比，模型组和siTrKB组AAT细胞的G0/G1期时间分别缩短和延长。采用流式细胞术测定SiHa中对照组、模型组、siNC组和siTrKB组的细胞周期。（J） 不同组之间的细胞周期比较显示，与相应的SiHa细胞（对照）相比，模型组和siTrKB组中AAT细胞的G0/G1期时间分别缩短和延长。
图6。
图6。
沉默TrkB后，AAT细胞中上调的细胞周期相关蛋白（包括细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1和c-Myc）减少。（A-C）对于HeLa细胞，分别通过western blot分析和RT-qPCR分析，模型组细胞中cyclin A、cyclin D1和C-Myc的蛋白和mRNA表达水平与对照组细胞相比上调，而siTrKB组细胞中的表达水平下调。（D-F）对于SiHa细胞，分别通过western印迹分析和RT-qPCR测定，来自模型组的细胞中细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1和c-Myc的蛋白质和mRNA的表达水平与来自对照组的细胞相比显著上调，而在来自siTrKB组的细胞中明显降低*与对照组相比，P<0.05；#与siTrKB相比，P<0.05。
图7。
图7。
敲除TrKB后，ATT细胞中caspase-3和Bax的增强表达以及Bcl-2的减弱被逆转。（A和B）对于HeLa细胞，western blot分析显示，与对照细胞相比，模型组细胞中caspase-3和Bax蛋白显著减少，Bcl-2显著增加，而siTrKB组细胞中的这些变化被逆转。（C） 此外，RT-qPCR检测表明，mRNA表达谱与蛋白质表达谱相似。（D和E）与对照细胞相比，SiHa细胞中caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著增加，Bcl-2的表达略有增加。然而，这些变化在TrKB处理的细胞中显著逆转。（F） RT-qPCR检测表明，mRNA表达与蛋白质表达相似*与对照组相比，P<0.05；#与siTrKB相比，P<0.05。
图8。
图8。
在TrKB表达下调的细胞中，PI3K和Akt的磷酸化增强被降低。对于（A）HeLa和（B）SiHa细胞，与对照组细胞相比，模型组细胞中PI3K的磷酸化明显增加，而siTrKB组细胞中的PI3K磷酸化与模型组细胞相比显著降低。然而，在各组中未观察到PI3K蛋白的显著变化。对于（C）HeLa和（D）SiHa细胞，与对照组细胞相比，模型组细胞中Akt的磷酸化明显增加，而siTrKB组细胞中的Akt磷酸化明显低于模型组细胞。然而，在各组中未观察到Akt蛋白的显著变化*与对照组相比，P<0.05；#与siTrKB相比，P<0.05。
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