The Hsp70 inhibitor 2-phenylethynesulfonamide inhibits replication and carcinogenicity of Epstein-Barr virus by inhibiting the molecular chaperone function of Hsp70

doi:10.1038/s41419-018-0779-3

。2018年6月29日；9(7):734.

doi:10.1038/s41419-018-0779-3。

Hsp70抑制剂2-苯乙炔磺酰胺通过抑制Hsp70的分子伴侣功能抑制EB病毒的复制和致癌性

附属公司

¹武汉大学基础医学院病原生物学系，武汉，430071。
²中山大学医学院（深圳），广州，510080，中国。
^三武汉大学第二临床学院，武汉，430071，中国。
⁴武汉大学基础医学院病理生理学系，武汉，430071。
⁵武汉大学基础医学院病原生物学系，湖北省变态反应与免疫相关疾病重点实验室，病毒学国家重点实验室，武汉，430071，中国。xsun6@whu.edu.cn。

PMID： 29959331
PMCID公司： PMC6026193型
内政部： 10.1038/s41419-018-0779-3

Hsp70抑制剂2-苯乙炔磺酰胺通过抑制Hsp70的分子伴侣功能抑制EB病毒的复制和致癌性

Huan Wang（王欢）等。细胞死亡病。 2018。

。2018年6月29日；9(7):734.

doi:10.1038/s41419-018-0779-3。

作者

Huan Wang（王欢）¹, 郎布^1 2, 王超（Chao Wang）¹, 张亚倩¹, Heng Zhou公司¹, Xi Zhang（西张）^三, 魏国⁴, 丛龙¹, 郭德银², 孙晓平⁵

附属公司

¹武汉大学基础医学院病原生物学系，武汉，430071。
²中山大学医学院（深圳），广州，510080。
^三武汉大学第二临床学院，武汉，430071，中国。
⁴武汉大学基础医学院病理生理学系，武汉，430071。
⁵武汉大学基础医学院病原生物学系，湖北省变态反应与免疫相关疾病重点实验室，病毒学国家重点实验室，武汉，430071，中国。xsun6@whu.edu.cn。

PMID： 29959331
PMCID公司： PMC6026193型
内政部： 10.1038/s41419-018-0779-3

摘要

EB病毒可在潜伏期和溶解期感染细胞，引起严重疾病。EB病毒核抗原1（EBNA1）对EB病毒DNA外显体的维持、复制和转录至关重要。2-苯乙炔磺酰胺（PES）是热休克蛋白70（Hsp70）的一种小分子抑制剂，它可以与Hsp70相互作用，并破坏其与Hsp70-共伴侣蛋白和底物蛋白的结合。在我们的研究中，我们发现PES可以降低EBNA1的表达，这与EBNA1转录或蛋白酶体降解途径的影响无关。PES抑制EBNA1表达不需要中央甘氨酸-丙氨酸重复序列域。此外，聚醚砜还可以减少细胞内EBV基因组DNA的数量。PES抑制EBV阳性细胞的增殖和迁移，但诱导细胞周期阻滞和凋亡。此外，Hsp70沉默降低了EBNA1的表达和细胞内EBV基因组DNA的数量，而PES以剂量依赖的方式增加了这种效应。相反，Hsp70的过表达增加了EBNA1的表达和细胞内EBV基因组DNA的数量，但PES以剂量依赖的方式抑制了这种作用。此外，Hsp70与EBNA1相互作用，但PES干扰了这种相互作用。我们的结果表明，PES通过抑制Hsp70的分子伴侣功能来抑制EB病毒的复制和致癌性。

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**图1。PES降低EBNA1的表达，并且PES抑制EBNA1的表达不需要GAr结构域。**
一HONE1/Akata、HK1/Akada和B95-8细胞用图中提到的聚醚砜浓度处理48个小时。b条HONE1/Akata、HK1/Akada和B95-8细胞未经处理，并检查了Hsp70的自然表达水平。**c（c）**用空载体pSG5或pSG5-LMP1转染HONE1/Akata细胞，然后用44 用40进行h处理 µM PES从4开始转染后h。提取全细胞蛋白并进行western印迹。d日用药物载体控制或PES（40、40或10）处理HONE1/Akata、HK1/Akada和B95-8细胞 24和48μM） h、分别是。提取总RNA并反向转录到cDNA。通过RT-PCR检测EBNA1转录物的水平。用载体对照物处理的细胞中EBNA1转录水平设置为1。**e（电子）**用空载体pSG5-EBNA1或pSG5-EBNA1ΔGA转染HONE1/Akata、CNE1和HeLa细胞4 h、然后是44 40小时治疗 µM聚醚砜。**（f）**用指示浓度的聚醚砜处理HONE1/Akata和B95-8细胞48 在不存在或存在蛋白酶体抑制剂MG-132（10 µM）对于最后16个小时。克用pSG5-EBNA1转染HONE1/Akata、CNE1和HeLa细胞4 h、然后是44 用40进行h处理在没有或存在MG-132（10）的情况下，µM PES µM）小时。小时HONE1/Akata和B95-8细胞用图中提到的聚醚砜浓度处理48 在CHX（50）不存在或存在的情况下 μg/ml）小时。我用pSG5-EBNA1ΔGA转染HONE1/Akata、CNE1和HeLa细胞，然后用48 用40进行h处理 µM PES从4开始在没有或存在MG-132（10）的情况下转染后h µM） h.使用western blotting分析全细胞提取物

**图2。聚醚砜减少EBV在HONE1/Akata和B95-8细胞中的溶解复制。**
一HONE1/Akata和b条TPA是否诱导B95-8细胞（40或20 ng/ml）和NaB（3 mM）用于4 h、然后是44 h处理ACV或PES梯度浓度。用EBNA1引物制备细胞内基因组DNA并用RT-PCR进行定量。将每个样本归一化为GAPDH基因的数量。**c（c）**HONE1/Akata和d日TPA和NaB诱导B95-8细胞4次 h、然后用指示浓度的聚醚砜处理44 h.提取全细胞蛋白，并通过蛋白质印迹进行分析。**e（电子）**,**（f）**用TPA和NaB诱导HONE1/Akata细胞，然后用44 h处理，从4开始增加PES浓度 EBV诱导后h。收集未经处理的HONE1细胞和处理后的HONE1/Akata细胞，并用流式细胞仪进行评估，以分析GFP的强度(**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001)

**图3。PES抑制EBV阳性细胞的增殖和迁移。**
一HONE1/Akata，电话：，b条HK1/Akata，**c（c）**B95-8和d日对HK2细胞进行24、48和72次PES浓度增加或不增加处理 h、分别是。**e（电子）**HONE1/Akata和**（f）**用pEF-Flag-Hsp70转染HK1/Akata细胞，然后用PES处理（20，40 μM）从4开始转染后h。克HONE1/Akata和小时用Hsp70 siRNA转染HK1/Akata细胞，然后用PES处理（20，40 μM）从4开始转染后h。通过CCK-8分析测定细胞活力。我HONE1/Akata和HK1/Akada细胞是否用PES处理（20或40 μM），再培养15天。采用集落形成实验测定PES对细胞增殖的长期影响。电话1/Akata(j个,我)和HK1/Akata(k个,米)细胞用线性划痕伤口处理，然后用PES（0、5、10、20或40 μM）用于24和48 h.然后观察细胞向伤口的迁移。使用Image J软件拍摄并分析照片

**图4。PES诱导EBV阳性细胞的细胞周期阻滞和凋亡。**
一用指定浓度的PES处理HONE1/Akata、HK1/Akada和B95-8细胞24小时 h、然后用PI染色。流式细胞仪检测细胞周期。b条HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8细胞用上述浓度的PES处理48小时 h，然后用V-PE/7-AAD染色。使用流式细胞仪进行凋亡细胞分析。**c（c）**HONE1/Akata和d日HK1/Akata细胞用40 μM PES，然后通过单剂量辐射（2 Gy）。48岁之后 h、通过CCK-8测定法测定细胞活力。**e（电子）**用上述浓度的聚醚砜处理HONE1/Akata、HK1/Akada和B95-8细胞48 h.提取全细胞蛋白并进行western印迹。**（f）**用40 48μM PES h.然后用组织蛋白酶D抗体对细胞进行染色，并使用Leica共焦LCS-SP8-STED纳米显微镜进行可视化。克用SC-514（100）处理B95-8细胞 μM）和聚醚砜（10 μM）用于48 h，然后用V-PE/7-AAD染色。使用流式细胞仪进行凋亡细胞分析(***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001)

图5
**Hsp70诱导的EBNA1表达变化与GAr结构域无关，Hsp70促进EBV在HONE1/Akata细胞中的裂解复制，但PES抑制这种作用。**用pEF-Flag-Hsp70转染HONE1/Akata细胞(一)或Hsp70 siRNA(b条)24小时 h、然后用聚醚砜（20或40 μM）用于48 小时。**c（c）**用pEF-Flag-Hsp70转染HONE1/Akata和HeLa细胞24小时 h、然后用pSG5-EBNA1或pSG5-EBNA1ΔGA转染上述细胞48 小时。d日Hsp70 siRNA转染HONE1/Akata和HeLa细胞24小时 h、然后用pSG5-EBNA1或pSG5-EBNA1ΔGA转染上述细胞48 h.提取上述全细胞蛋白并进行蛋白质印迹。TPA和NaB诱导HONE1/Akata细胞4 h、然后转染pEF-Flag-Hsp70(**e（电子）**)或Hsp70 siRNA(克)然后从4开始进行PES治疗转染后h。用EBNA1引物RT-PCR定量细胞内基因组DNA。将每个样本归一化为GAPDH基因的数量。**（f）**,小时提取上述全细胞蛋白质，并用western blotting进行分析(***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001)

**图6。EBNA1与Hsp70相互作用，但PES干扰这种相互作用。**
一在pSG5-EBNA1存在下，用pEF-Flag-Hsp70转染293T细胞。48岁时转染后h，用Flag抗体进行IP分析，然后用指示的抗体进行免疫沉淀。b条分别或同时用pSG5-EBNA1和pEF-Flag-Hsp70转染293T细胞，然后用载体药物对照或PES（20 μM）从4开始转染后h。48 h后，进行IP分析。用pSG5-EBNA1转染HeLa细胞(**c（c）**)仅pEF-Flag-Hsp70(d日)并与pSG5-EBNA1和pEF-Flag-Hsp70联合转染(**e（电子）**).（f）TPA和NaB诱导HONE1/Akata细胞。48岁时转染或诱导后h，固定细胞，用抗体染色，然后使用Leica共焦LCS-SP8-STED纳米显微镜进行可视化

**图7。PES抑制体内肿瘤生长。**
用载体对照（PBS）或8 mg/kg PES，持续5天。体重(一)，肿瘤重量(b条)和肿瘤体积(**c（c）**)在上述BALB/c裸鼠中进行评估。整个值显示为平均值 ± 六只小鼠的SD。d日显示了用PBS或PES治疗的小鼠和上述小鼠肿瘤的代表性图像。**e（电子）**western blotting分析肿瘤组织的裂解物。**（f）**,克通过静脉X射线成像系统评估上述小鼠肿瘤中GFP的强度。小时H&E染色检测上述小鼠的五个重要器官（心、肝、脾、肺和肾）。我使用抗EBNA1的抗体通过免疫组织化学染色来检测肿瘤组织。给出了随机选择的显微照片(****P（P）* < 0.001)

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