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.2018;9(1):350-367.
doi:10.1080/19491034.2018.1471936。 Epub 2018年6月26日。

核仁素调节组蛋白2B-ECFP在核仁中的分区和动力学

阿扬蒂卡·森·古普塔 1, 高拉夫·乔希 1, 苏米特·帕瓦尔 1, 昆丹·森古普塔 1
附属公司

核仁素调节组蛋白2B-ECFP在核仁中的分区和动力学

阿扬蒂卡·森·古普塔等。 核. 2018.

摘要

真核细胞有2到​核糖体合成所需的3个离散核仁。核小体是相分离的核亚细胞器。在这里，我们研究了细胞核层粘连蛋白和核仁因子在调节组蛋白2B（H2B-ECFP）在核仁中的区室化和动力学中的作用。标记H2B的活体成像和光漂白后荧光恢复（FRAP）表明，拉明B1、纤维素酶（FBL）或核固醇（GNL3）的耗竭增强了H2B-ECFP在核仁中的迁移率。此外，Nucleolin敲除显著降低了核仁中H2B-ECFP的区隔化，而H2B-ECFP在核仁中的驻留和迁移随着Nucleoliin的过度表达而延长。核仁蛋白N末端和RNA结合域（RBD）缺失突变体的共表达或抑制45S rRNA合成可减少H2B-ECFP在核仁中的固存。总之，这些研究揭示了核仁蛋白-rRNA复合物在调节核仁内H2B的分区、稳定性和动力学方面的关键作用。

关键词：H2B；核仁；层粘连蛋白；核仁蛋白；细胞核；rRNA。

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数字

图1。
图1。
组蛋白2B-ECFP定位于细胞核。（a） H2B-ECFP明显定位于核质和核仁中。顶部面板：H2B-ECFP的核质定位，中间面板：H2B-ECFP在核仁中的定位（黑色箭头）。底部面板：NLS-CFP定位于核质和核仁（黑色箭头）。比例尺~5μm。（b） 所有转染细胞的核质中都含有H2B-ECFP，而这些细胞中约40%的细胞核中含有H2B-EC FP。所有细胞在核质中均显示NLS-CFP，而约98%的细胞在核仁中显示NLS-CFRP，n=细胞核数量，数据来自n=2个独立的生物复制。（c） Nucleolin免疫染色用H2B-ECFP标记DLD1、HCT116和MCF7细胞中的核仁（白色箭头）。白色轮廓标出单个核，比例尺~5μm。（d） 用抗组蛋白2B抗体和抗核仁蛋白抗体对转染H2B-ECFP的细胞进行免疫染色，以标定核仁（白色箭头），抗组蛋白2 B抗体检测转染细胞和核仁中内源性H2B。（e） Lamin A/C、B1、B2、FBL和GNL3的独立敲除不影响标记的H2B-ECFP的核仁定位程度，n=细胞核数量，从n=3个独立生物复制品编译的数据，误差栏：SEM。Student t检验，p>0.05（n.s：不显著）。
图2。
图2。
拉明B1缺失增强了核仁中H2B–ECFP的流动性。（a–c）由（a）LMNA/c（b）LMNB1和（c）LMNB2敲除制备的全细胞裂解物的蛋白质印迹。控制：未处理，干扰siRNA。加载控制：肌动蛋白。（d–e）典型图像，显示（d）核仁和（e）对照核、LMNA/C Kd、LMNB1 Kd和LMNB2 Kd细胞中H2B-ECFP的FRAP。黄色方框表示漂白ROI。比例尺~5µm。（f–h）归一化荧光恢复曲线，比较对照组、（f）LMNA/C Kd（g）LMNB1 Kd和（h）LMNB2 Kd细胞中H2B-ECFP的恢复。（i） 根据（f–h）计算得出的核仁中H2B-ECFP的相对流动分数，表明H2B-ECFF在核仁中的流动性增加。（j–l）对照细胞核中H2B-ECFP的归一化荧光恢复曲线，（j）LMNA/C Kd（k）LMNB1 Kd（l）LMNB2 Kd细胞。（m） 根据（j–l）计算的细胞核中H2B-ECFP的相对流动分数。层粘连蛋白敲低不影响细胞核中H2B-ECFP的迁移率，n=细胞核数量，从n=3个独立的生物重复中汇编的数据，误差条：恢复曲线和条形图中的SEM。学生t检验，*p<0.05。
图3。
图3。
纤维素酶（FBL）和核固醇（GNL3）的耗竭增强了H2B–ECFP在核仁中的流动性。（a，b）敲除（a）纤维素酶（FBL）（b）核糖核酸酶（GNL3）后，DLD1细胞制备的全细胞裂解物的蛋白质印迹，对照：未经处理的和各自的干扰siRNA处理的细胞。加载控制：Tubulin、Actin。（c，d）H2B-ECFP在（c）核仁和（d）对照核、FBL和GNL3 Kd细胞中的FRAP。黄色方框表示漂白ROI。比例尺~5µm。（e，f）比较对照（e）FBL-Kd和（f）GNL3-Kd细胞的核仁中H2B-ECFP的回收率的归一化荧光回收曲线。（g） 根据（e，f）计算核仁中H2B-ECFP的相对流动分数。（h，i）比较对照细胞核中H2B-ECFP恢复的归一化荧光恢复曲线，（h）FBL Kd（i）GNL3 Kd细胞。（j） 根据（h，i）计算的细胞核中H2B-ECFP的相对流动分数，n=细胞核数量，n=3个独立生物复制的数据，误差条：恢复曲线和条形图中的SEM。学生t检验，*p<0.05，**p<0.01。
图4。
图4。
核仁素水平调节核仁中H2B-ECFP的分隔。（a） DLD1细胞中核仁蛋白敲除（NCL-Kd）后H2B-ECFP实时成像的代表性图像。对照组：未经处理和打乱的siRNA处理细胞。比例尺~5µm。（b） （i）对全细胞裂解物进行蛋白质印迹，以检测未经处理、打乱和NCL siRNA处理的DLD1细胞中的Nucleolin水平。加载控制：动作。（ii）Nucleolin击倒后，H2B-ECFP表达略有增加。装载控制：Tubulin。（c） NCL敲除时显示核仁H2B-ECFP隔室的细胞百分比（Kd），n=细胞核数，来自n=3个独立生物复制的数据，误差栏：SEM。NPM1敲除时，显示核仁H_2B-ECFP-的细胞百分比，n=核数，来自n=2个独立生物重复的数据，错误栏：SD。NCL Kd上显示核仁NLS-CFP的细胞百分比，n=细胞核数量，来自n=2个独立生物复制的数据，误差栏：SD。学生t检验，***p<0.001。（d） NCL-GFP过度表达的核仁H2B-ECFP。仅转染H2B-ECFP的DLD1细胞（对照，白色条）和联合转染H2B-ECFP和NCL-GFP（+NCL-GFP，黑色条）的细胞在转染后24、48和72小时进行成像。NPM1-GFP过度表达24小时后显示核仁H2B-ECFP的细胞百分比，n=细胞核数，来自两个独立生物复制品的数据，n=2，错误栏：SD。（e）显示H2B-ECFP转染CRL1790、DLD1、HCT116和MCF7细胞核仁定位的实时成像代表性图像。比例尺~5µm。（f） Western blot显示CRL1790、DLD1、HCT116和MCF7细胞中NCL的内源性水平。加载控制：Tubulin、Actin。核仁蛋白强度标准化为负荷控制。（g） CRL1790、DLD1、HCT116、MCF7细胞和联合转染NCL-GFP的DLD1细胞核仁中H2B-ECFP的范围，n=细胞核数量，来自两个独立生物复制的数据，n=2。
图5。
图5。
核糖核酸酶水平与H2B-ECFP的迁移率呈正相关。（a） 与NCL-GFP（DLD1+NCL-GFP-OE）联合转染的DLD1、HCT116、MCF7和DLD1细胞核仁中H2B-ECFP的FRAP，比例尺~5µm。（b） 核仁中H2B-ECFP的归一化荧光恢复曲线。（c） H2B-ECFP的相对流动分数根据（b）计算，n=细胞核数，n=3个独立生物复制的数据，误差条：恢复曲线和条形图中的SEM。学生t检验，*p<0.05。
图6。
图6。
核仁蛋白与核仁中的H2B-ECFP结合。（a） 内源性Nucleolin和NCL-GFP与抗Nucleolin抗体的免疫共沉淀（Co-IP）揭示了其与H2B-ECFP的相互作用。正常IgG用作Co-IP的对照。western blot检测H2B-ECFP。数据来自N=2个独立的生物复制。（b） 显示Nucleolin三个主要结构域的示意图。数字表示Nucleolin各结构域的氨基酸位置。联合转染H2B-ECFP和全长NCL（NCL-FL）、N末端缺失（NCLΔN）、RNA结合域缺失（NCL-ΔRBD）或GAR域缺失（NCLΔGAR）的DLD1细胞的代表性图像。H2B-ECFP和FL-NCL在核仁中显示共定位。NCL△RBD和NCL△GAR除了核仁定位外，还显示核质定位。比例尺，5µm。（c） 联合表达NCL-FL、NCLΔN、NCL△RBD和NCL△GAR时显示核仁H2B-ECP的细胞百分比，N=细胞核数量，来自N=3个独立生物复制的数据，误差栏：SEM.ANOVA，***p<0.001。（d） 载体（DMSO）和放线菌素d（Act d，0.05μg/ml）处理细胞中45S前rRNA的qRT-PCR，N=2。Act D处理后，所有细胞中45S前rRNA水平下调。对照组（+DMSO）细胞的所有统计数据，方差分析，***p<0.001。（e） DMSO或Act D处理后，仅表达H2B-ECFP或共同表达NCL-GFP的细胞的代表性图像。插图–Act D处理后的Nucleolin斑点，不显示H2B-ECFP，比例尺~5μm。（f） Act D处理后显示核仁H2B-ECFP的细胞百分比定量（从e开始），n=细胞核数量，n=2个独立的生物复制。方差分析，*p<0.05。
图7。
图7。
核仁素调节核仁分裂的推测模型和H2B-ECFP的动力学。1.核仁蛋白通过其N末端结构域与H2B-ECFP相互作用，并将其穿梭到核仁中。在核仁中，核仁蛋白通过其RNA结合域与前rRNA结合，通过其N末端域与H2B-ECFP结合，从而在核仁内保留H2B-ECFF。有核仁蛋白存在时，H2B-ECFP进入核仁的相对速率可能更大。2.在缺少N末端结构域的情况下，Nucleolin不与H2B-ECFP结合，从而减少H2B-ECFP的核仁库。3.核仁蛋白RBD缺失突变体通过其N末端结构域与H2B-ECFP结合，并将H2B-ECFP隔离到核仁中。然而，在没有RBD的情况下，H2B-ECFP不会保留在核仁中，因为RBD是与前rRNA结合所必需的。GAR结构域缺失突变体与H2B-ECFP和前rRNA结合，并显示H2B-ECFP向核仁中的募集增强，类似于全长Nucleolin。5.Nucleolin在核仁中导入H2B-ECFP，但在缺乏由Act D抑制的前rRNA转录的情况下不能将其保留在核仁中。
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