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.2018年6月；10（6）：e8558。
doi:10.15252/emmm.201708558。

一种新的CHCHD10突变暗示ALS中存在依赖Mia40的线粒体输入缺陷

卡琳娜·莱默 1, 马丁·施鲁迪 1 2, Linnea Ransom公司 1, 约翰娜·格雷林 1, 迈克拉·荣格 1, 妮可·埃克斯纳 三, 亨里克·里门施奈德 1, 朱莉·范德泽 4 5, 克里斯汀·范·布勒克霍温 4 5, 帕特里克·韦德 6, 迈克尔·T·海内卡 6 7, 迪特尔·埃德鲍尔 8 2
附属公司

一种新的CHCHD10突变暗示ALS中存在依赖Mia40的线粒体输入缺陷

卡琳娜·莱默等。 EMBO分子医学. 2018年6月.

摘要

CHCHD10突变与肌萎缩侧索硬化症有关，但其作用模式尚不清楚。在一名疾病进展迅速的29岁患者中，我们在卷曲螺旋-卷曲螺旋（CHCH）结构域内的保守残基中发现了一种新的突变（Q108P）。侵袭性临床表型促使我们探究其致病性。与野生型蛋白质不同，CHCHD10 Q108P的线粒体输入几乎完全被阻断，导致弥漫性细胞质定位和稳定性降低。患者中报告的其他CHCHD10变异体显示线粒体输入受损（C122R）或线粒体内聚集（尤其是G66V和E127K），通常与表达降低有关。截短实验表明CHCHD10的线粒体输入是由CHCH结构域介导的，而不是拟议的N末端线粒体靶向信号。敲除Mia40，将二硫键引入CHCH结构域蛋白，阻断CHCHD10的线粒体输入。Mia40的过度表达通过增强二硫键形成拯救了CHCHD10 Q108P的线粒体输入。由于CHCHD10的减少抑制呼吸，其CHCH结构域的突变可能通过损害线粒体输入而导致侵袭性疾病。我们的数据表明，Mia40上调是一种潜在的治疗补救途径。

关键词：CHCHD10；肌萎缩侧索硬化；遗传学；线粒体。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。CHCHD10 Q108P抑制线粒体输入
  1. A类

    对一名ALS患者的基因组DNA进行PCR扩增，并进行Sanger测序。荧光图显示CHCHD10.

  2. B类

    CHCHD10的结构域结构和已知突变。R15L定位于假定的线粒体靶向信号（“MTS”）中，S59L和G66V位于疏水区，Q108P位于CHCH域。

  3. C–F类

    转染HeLa细胞（C-E），并用HA标记的CHCHD10（D10-HA）野生型（WT）、Q108P或R15L转导初级海马神经元（F）。通过线粒体ATP合酶亚基（ATP5A1）的共染色分析CHCHD10-HA（D10-HA）的线粒体定位。选择具有类似表达水平的细胞进行成像。比例尺代表10μm。（D） 转染HeLa细胞线粒体和胞浆的生化分离。使用HA、CHCHD10 C末端（D10‐CT）、ATP5A1和肌动蛋白抗体进行免疫印迹。（E） 线粒体（归一化为ATP5A1）和细胞溶质（归一化为肌动蛋白）组分中CHCHD10-HA（D10-HA）的蛋白质定量。数据显示为平均值±SD。单向方差分析（后面是Dunnett的事后（post-hoc）WT测试）：n个=3个生物复制品，线粒体WT与Q108P：*P（P）= 0.0135.

可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。CHCHD公司10个突变体不太稳定

  1. 转染空载体（Ctrl）或HA标记CHCHD10变体（WT、Q108P或R15L）的HeLa细胞的全细胞裂解液中CHCHD10-HA（D10-HA）水平。

  2. 用所示HA标记的CHCHD10构建物转染HeLa细胞的免疫荧光图片（右）中CHCHD10-HA（D10-HA）和ATP5A1强度的行扫描。沿着6.5微米长的线（黄色）测量红色（ATP5A1，此处以洋红色显示）和绿色（D10‐HA）通道的强度，并使用ImageJ中的插件RGB‐profiler生成图表。比例尺代表10μm。

  3. 在转染2天的HeLa细胞中测量HA标记的CHCHD10（WT、Q108P或R15L）的蛋白质稳定性，然后用环己酰亚胺（+CHX）或载体（+DMSO）处理并在0、4、8和24小时后收获。注意，DMSO处理细胞中CHCHD10 Q108和R15L的稳态水平在24小时（即转染后3天）也较低。

  4. HA标记的CHCHD10（D10‐HA）蛋白水平的量化标准化为ATP5A1。用环己酰亚胺处理转染的HeLa细胞0、4、8和24小时。数据显示为平均值±SD。双向方差分析（随后是土耳其的多重比较）：n个=3个生物复制，t吨=4小时WT与Q108P：***P（P） < 0.0001,t吨=4小时WT与R15L：**P（P） = 0.002,t吨=8小时WT与Q108P：***P（P） < 0.0001,t吨=8小时WT与R15L：**P（P）= 0.0076.

  5. 通过非线性回归分析计算各CHCHD10变异体的半衰期分析。数据显示为平均值±SD。n=3生物复制。

图2
图2。CHCHD10的部分丧失降低了备用呼吸能力
  1. A–C

    用靶向CHCHD10（siD10）或对照（siCtrl）的siRNA转染HeLa细胞。（A） 定量RT-PCR和免疫印迹（使用C端抗体）显示CHCHD10敲除。mRNA水平标准化为GAPDH公司和企业对企业mRNA。数据显示为平均值±SD。韦尔奇的t吨‐测试用于统计分析：n个=3个生物复制品*P（P）= 0.0102. （B，C）使用海马细胞外流量分析仪实时定量线粒体呼吸。氧气消耗率以pmol O为单位进行测量2并归一化为总蛋白浓度。测量基础呼吸后，添加寡霉素以抑制ATP合成酶（质子泄漏），然后添加解偶联剂FCCP（最大呼吸）和抗霉素A/鱼藤酮（非线粒体耗氧量）。对剩余呼吸量（最大呼吸量与基础呼吸量之差）进行统计分析。数据显示为平均值±SD。T型‐测试：n个=11个生物复制，***P（P） < 0.0001.

  2. D–F型

    使用CRISPR/Cas9在单倍体HAP1细胞中灭活CHCHD10，导致提前终止密码子（p.Leu110HisfsTer5，以下简称D10 fs）。（D） 定量RT-PCR和免疫印迹（使用C端和N端抗体）显示，在D10 fs细胞中CHCHD10 mRNA表达强烈减少，全长蛋白丢失。mRNA水平标准化为GAPDH公司和企业对企业mRNA。数据显示为平均值±SD。韦尔奇的t吨‐测试用于统计分析：n个=3个技术副本*P=0.0125. （E，F）线粒体呼吸分析如（B，C）所示。对剩余呼吸量（最大呼吸量与基础呼吸量之差）进行统计分析。数据显示为平均值±SD。T型‐测试：n个=7个技术重复，**对=0.0022。给出了几个实验的代表性实验。

  3. G–I型

    将一名Q108*突变的FTD患者的淋巴细胞与三名野生型CHCHD10对照患者的淋巴细胞进行比较。（G） 定量RT-PCR和免疫印迹（使用C端和N端抗体）显示Q108*患者细胞中CHCHD10 mRNA表达和50%CHCHD10-蛋白减少。mRNA水平标准化为GAPDH公司和企业对企业mRNA。数据显示为平均值±SD。单向方差分析（后面是Dunnett的事后（post-hoc）针对Q108的测试*）用于统计分析：n个=3个技术副本，2008年第1季度*与Ctrl1：***P（P）= 0.0004，Q108*与Ctrl2：*对 = 0.0338，Q108*与Ctrl3：*对 = 0.0105. （H，I）在放置等量淋巴母细胞后1 H分析线粒体呼吸。对剩余呼吸量（最大呼吸量与基础呼吸量之差）进行统计分析。数据显示为平均值±SD。采用单向方差分析法对两个具有类似结果的独立实验中的一个进行了分析（随后是Dunnett的事后（post-hoc）Q108测试*）：n个=4个技术复制，Q108*与Ctrl1：***P（P）= 0.0001，Q108*与Ctrl2：**P（P）= 0.0017，Q108*与Ctrl3：***P（P）= 0.0001.

图3
图3。CHCH结构域对于CHCHD10的线粒体输入是必要的
用CHCHD10变体（D10-HA）和GFP融合蛋白转染HeLa细胞。
  1. A–D

    （A，D）使用ATP5A1作为线粒体标记蛋白的双重免疫荧光。显示具有类似表达水平的细胞。比例尺表示10μm。（B，C）使用抗HA、ATP5A1和肌动蛋白的抗体对线粒体和胞质溶胶的生物化学分级进行代表性免疫印迹，然后对相应的CHCHD10截短突变体进行定量分析。HA标记的CHCHD10（D10-HA）水平被标准化为ATP5A1（针对线粒体）或肌动蛋白（针对胞质溶胶）。数据显示为平均值±SD。单向方差分析（后面是Dunnett的事后（post-hoc）WT测试）：n个=3-4个生物复制，线粒体：WT与ΔCHCH**P（P）= 0.0013，WT与Q108***P（P）= 0.0019，WT与Q108P**P（P） = 0.0030，重量与ΔNT‐Q108P**P（P） = 0.0020; 细胞质：WT与Q108**P（P）= 0.0428.

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图EV2
图EV2。进口赤字为CHCHD公司10 Q108P是用高表达的合成基因复制的

  1. 密码子优化合成CHCHD10基因的序列，用于减少GC含量，以便于克隆许多患者衍生变体。

  2. 比较转染CHCHD10构建物的HeLa细胞的全细胞裂解液中HA标记的CHCHD1O（D10-HA）蛋白水平，该构建物包含原始cDNA或密码子优化合成cDNA。

  3. 通过与线粒体标记物（ATP5A1）共染色，分析转染HeLa细胞中合成CHCHD10-HA（D10-HA）的线粒体定位。比例尺代表10μm。

图4
图4。CHCHD10患者变体对定位和表达的差异效应
用HA标记的CHCHD10（D10-HA）患者变体转染HeLa细胞。

  1. 与线粒体标记ATP5A1相比，免疫荧光显示CHCHD10‐HA变体的表达模式。箭头表示线粒体内CHCHD10聚集。比例尺表示10μm。

  2. 全细胞裂解物免疫印迹中CHCHD10水平的定量。数据显示为平均值±SD。单向方差分析（后面是Dunnett的事后（post-hoc）WT测试）：n个=3–6个生物重复，WT与R6G：*对 = 0.0145，重量与R15S：***P（P）= 0.0001，重量与P23S：*P（P）= 0.0189，WT与A32D：***P（P）= 0.0001，重量与P34S：***P（P）= 0.0001，重量与A35D：**P（P）= 0.0044，重量对G58R：**P（P）= 0.0029，WT与G66V：***P（P）= 0.0001，WT与Q108P：***P（P）= 0.0001，重量对C122R*对 = 0.0146.

  3. 使用HA、ATP5A1和肌动蛋白抗体对表达不同CHCHD10患者变异体的转染HeLa细胞的线粒体和胞浆进行免疫印迹分析。

  4. CHCHD10‐HA蛋白水平的量化标准化为线粒体ATP5A1。数据显示为平均值±SD。单向方差分析（与Dunnett’s事后（post-hoc）WT测试）：n个=4个生物复制品，线粒体CHCHD10 WT与Q108P：*对 = 0.0156，重量与C122R：*P（P）= 0.0172之间。

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图EV3
图EV3。亚细胞分布CHCHD公司10个患者变种
  1. A、 B类

    将HA标记的CHCHD10（D10-HA）患者变异体转染HeLa细胞，分为两组（A组和B组）。与线粒体标记ATP5A1相比，免疫荧光显示CHCHD10-HA（D10-HA）变体的表达模式。比例尺代表10μm。

图5
图5。CHCHD10的线粒体输入依赖于Mia40
  1. A–D

    用靶向CHCHD10、Mia40、AIFM1、Erv1或对照（siCtrl）的siRNA转染HeLa细胞。（A） 定量RT-PCR证实CHCHD10、Mia40、AIFM1和Erv1的特异性敲除。mRNA水平标准化为GAPDH公司和企业对企业mRNA。数据显示为平均值±SD。使用单向方差分析（随后是Dunnett对siCtrl的多重比较测试）进行统计分析：n个=4个生物复制，siCtrl与siD10***P（P）=0.0001，siCtrl与siMia40***P（P）=0.0001，siCtrl与siAIFM1***P（P）=0.0001，siCtrl与siErv1***P（P） = 0.0001. （B） siRNA转染细胞中带有指示抗体的免疫印迹。（C） 将siRNA转染细胞归一化为肌动蛋白的CHCHD10蛋白定量。数据显示为平均值±SD。Kruskal–Wallis测试：n个=4个生物复制，siCtrl与siD10：**P（P）= 0.0013，siCtrl与siMia40:**对= 0.0136之间。（D） 与对照组（siCtrl）相比，Mia40敲低HeLa细胞的免疫染色显示CHCHD10的整体表达降低。一种针对线粒体编码的细胞色素c氧化酶II（MTCO2）的抗体标记线粒体。比例尺代表10μm。

  2. E类

    AMS分析评估转染CHCHD10‐HA野生型（WT）和突变体（Q108P，R15L）的HeLa细胞全细胞提取物中二硫键的形成。用硫醇反应交联剂AMS（10 mM，37°C，60 min）处理提取物，事先用DTT还原或不还原，并进行热变性（95°C，10 min），然后进行免疫印迹分析AMS诱导的CHCHD10凝胶从氧化（ox）形式转变为还原（红色）形式。注意，与野生型和R15L相比，95°C处理对CHCHD10 Q108P的AMS可及性没有额外影响，表明折叠受损。上下面板分别显示相同污点的短期和长期暴露。星号表示降解产物。

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图EV4
图EV4。Mia40可结合并稳定CHCHD公司10
  1. A类

    来自转染HeLa细胞的Mia40-MYC和CHCHD10-HA（D10-HA）野生型（WT）、变体（Q108P、R15L、ΔCHCH、Q108*）或空载体（Ctrl）的共免疫沉淀。输入代表用于免疫沉淀的全细胞裂解液的5%。用抗Mia40和HA抗体检测共免疫沉淀的免疫印迹。氧化还原酶Mia40与其底物CHCHD10的瞬时相互作用可以解释低结合。

  2. B类

    AMS处理显示HeLa细胞内内源性CHCHD10形成二硫键。注意，用N端抗体（D10‐NT）检测到的内源性CHCHD10显示出类似的模式。C-末端CHCHD10抗体对AMS偶联内源性CHCHD10-检测不良，表明表位与半胱氨酸残基重叠。Actin用作加载控制。请注意，DTT处理对肌动蛋白的AMS交联没有影响，因为肌动蛋白所有半胱氨酸在细胞质环境中都会减少。

  3. C类

    免疫印迹显示，在Mia40表达后，CHCHD10也在具有指示抗体的细胞溶质组分中升高。

  4. D、 E类

    在经环己酰亚胺（+CHX）处理的HeLa细胞中测量了HA标记的CHCHD10（WT、Q108P或R15L）在MIA40过度表达时的蛋白质稳定性，并与空载体共转染（Ctrl）进行了比较。在0、4、8和24小时后收集细胞。CHCHD10-HA（D10-HA）蛋白水平的量化标准化为ATP5A1。数据显示为平均值±SD。双向方差分析（使用Sidak的多重比较测试）：n个=4个生物复制品，重量：t吨=0小时Ctrl与Mia40：*对=0.0146，t吨=4小时控制与Mia40*P（P）= 0.0168; 问题108P：t吨=0小时控制与Mia40：**P（P）= 0.0039,t吨=4小时控制与Mia40**P（P）= 0.0089; R15升：t吨=0小时控制与Mia40：**P（P） = 0.0014.

图6
图6。Mia40过表达拯救CHCHD10突变体
HeLa细胞（A、C、D、E）的共转染和初级海马大鼠神经元（B）与HA标记的CHCHD10（D10-HA）变体和Mia40‐MYC或空载体（Ctrl）的共同转染。
  1. A、 B类

    免疫荧光显示野生型CHCHD10与Mia40共定位。比例尺代表10μm。Mia40的过度表达促进CHCHD10 Q108P的表达和线粒体定位。

  2. C、 D类

    与空载体相比，免疫印迹和线粒体部分的量化证实了CHCHD10的稳定性，并增加了Mia40表达后的线粒体定位。量化标准化为ATP5A1。数据显示为平均值±SD。Kruskal–Wallis测试：n个=4个生物复制。Q108P控制与Q108P Mia40*P（P）= 0.0126.

  3. E类

    AMS治疗显示，与野生型CHCHD10（内源性Mia40水平）相比，在Mia40表达后CHCHD10Q108P中形成二硫键。Actin用作加载控制。请注意，DTT处理对肌动蛋白的AMS交联没有影响，因为肌动蛋白所有半胱氨酸在细胞质环境中都会减少。星号表示降解产物。

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    1. ALSdb（2018）纽约市：(http://alsdb.org)1月访问。
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