E4BP4/NFIL3 modulates the epigenetically repressed RAS effector RASSF8 function through histone methyltransferases

doi:10.1074/jbc.RA117.000623

.2018年4月13日；293(15):5624-5635.

doi:10.1074/jbc。RA117.000623。 Epub 2018年2月21日。

E4BP4/NFIL3通过组蛋白甲基转移酶调节表观遗传学抑制的RAS效应物RASSF8功能

Isai Pratha Karthik公司¹, 帕维特拉·德赛¹, Sudarkodi Sukumar公司¹, 亚历山大·迪米特里耶维奇², 克里希纳拉·拉贾林加姆², 圣达拉萨米·马哈林根^三

附属公司

¹来自印度马德拉斯印度理工学院生物技术系Bhupat和Jyoti Mehta生物科学学院国家癌症组织生物银行分子病毒学实验室，邮编：600 036。
²分子信号单位——德国美因茨约翰内斯·古腾堡大学医学中心免疫学研究所，福舒尔免疫治疗中心，55131。
^三来自印度马德拉斯印度理工学院生物技术系Bhupat和Jyoti Mehta生物科学学院国家癌症组织生物银行分子病毒学实验室，邮编：600 036mahalingam@iitm.ac.in。

采购管理信息： 29467226
预防性维修识别码： PMC5900760型
内政部： 10.1074/jbc。RA117.000623号

E4BP4/NFIL3通过组蛋白甲基转移酶调节表观遗传抑制的RAS效应器RASSF8功能

Isai Pratha Karthik公司等。生物化学杂志. 2018.

.2018年4月13日；293(15):5624-5635.

doi:10.1074/jbc。RA117.000623。 Epub 2018年2月21日。

作者

Isai Pratha Karthik公司¹, 帕维特拉·德赛¹, Sudarkodi Sukumar公司¹, 阿列克桑德拉·迪米特里耶维奇², 克里希纳拉·拉贾林加姆², 圣达拉萨米·马哈林根^三

附属公司

¹来自印度马德拉斯印度理工学院生物技术系Bhupat和Jyoti Mehta生物科学学院国家癌症组织生物银行分子病毒学实验室，邮编：600 036。
²分子信号单位——德国美因茨约翰内斯·古腾堡大学医学中心免疫学研究所，福舒尔免疫治疗中心，55131。
^三来自印度马德拉斯印度理工学院生物技术系Bhupat和Jyoti Mehta生物科学学院国家癌症组织生物银行分子病毒学实验室，邮编：600 036mahalingam@iitm.ac.in。

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摘要

RAS蛋白是主要的人类致癌基因，大多数研究都集中在酶促RAS效应物上。最近，非酶RAS效应器（RASSF，RAS关联域家族）因其抑瘤特性而受到特别关注，与经典酶RAS作用器的致瘤潜能形成对比。尽管RASSF家族的大多数成员被启动子超甲基化解除了调控，但RASSF8启动子在许多癌症中仍然未甲基化，但其下调的机制尚不清楚。在这里，我们揭示了E4BP4是通过组蛋白甲基转移酶、G9a和SUV39H1抑制RASSF8表达的关键转录调节剂。与这些观察结果一致，我们注意到在原发性乳腺肿瘤样本中RASSF8和E4BP4的表达呈负相关。此外，我们的数据提供了证据，证明E4BP4可以减弱RASSF8介导的抗增殖和凋亡作用，从而从机制上揭示乳腺癌中RASSF9的下调。总之，我们的研究提供了对RASSF8功能表观遗传调控的更好理解，并暗示了更好治疗策略的发展。

关键词：E4BP4；G9a；RASSF8；Ras蛋白；SUV39H1；细胞凋亡；乳腺癌；细胞增殖；组蛋白甲基化；肿瘤细胞生物学；抑癌基因。

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利益冲突声明

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数字

**图1。**
**E4BP4是调节RASSF8表达的关键转录因子。** 一个HEK293细胞中RASSF8启动子的全长活性和指示变体。采用肾素荧光素酶作为内转染对照。相对光单位(*RLU（RLU）*)表示萤火虫发光和Renilla发光的比率。B类，指示转录因子结合基序在RASSF8-Pro中交换^−350/+1并在HEK293细胞中检测启动子活性。C和D类，E4BP4是一种调节RASSF8表达的关键转录因子。在与FLAG-E4BP4共转染的HEK293细胞中测定RASSF8启动子活性^重量(C)和FLAG-E4BP4^德国(D类). Western blot分析检测FLAG-E4BP4的表达^重量和FLAG-E4BP4^德国β肌动蛋白被用作负荷控制。E类和F类实时PCR分析表明FLAG-E4BP4的异位表达^重量下调内源性RASSF8水平的表达(E类)相反，FLAG-E4BP4^德国促进RASSF8 mRNA水平(F类)在HEK293细胞中。误差线是从三个独立实验的平均值±SD中得出的。

**图2。**
**组蛋白甲基化而非DNA甲基化下调RASSF8表达。** 一个对MCF-7、T47D、SKBR3和BT549细胞的亚硫酸氢转化基因组DNA进行甲基化特异性PCR。使用其他地方提到的引物进行PCR（14）。B类用RT-qPCR检测经5-氮杂脱氧胞苷（5μ米，72小时）或BIX-01294（6μ米，6小时）。CE4BP4、SUV39H1和G9a的表达抑制RASSF8-Pro^−2001/+1活动。Western blot分析检测E4BP4、SUV39H1和G9a的表达。D类，标志E4BP4^重量在MCF-7细胞中单独或联合表达G9a和SUV39H1，并通过RT-qPCR测定内源性RASSF8 mRNA水平。β肌动蛋白被用作内部对照。数值代表三个独立实验的平均值±S.D。

**图3。**
**RASSF8启动子中E4BP4的占有率。** 一个EMSA按照“实验程序”进行。未标记的野生型或突变寡核苷酸用于EMSA中的竞争。不含核提取物的寡核苷酸用作阴性对照。B类，通过将退火的寡核苷酸和MCF-7细胞的核提取物与抗E4BP4抗体孵育，进行超移分析。超位移络合物由*星号。C*，用E4BP4体外表达MCF-7细胞^重量和E4BP4^德国转染后48小时固定，并进行ChIP-PCR。D类和E类用5-氮杂脱氧胞苷（5μ米，72小时）和BIX-01294（6μ米6 h），并执行ChIP-PCR。RT-qPCR使用ChIP分析中的DNA免疫沉淀进行，并使用输入进行标准化。该图表示三个独立实验中相对于控制的-倍变化，误差条表示S.D。

**图4。**
**RASSF8抑制细胞增殖。** 一个，从BioXpress数据库检索RASSF8在不同癌症中的表达频率。表达频率用相应的正常样本进行标准化。B类，RASSF8在不同数据集中的正常和乳腺癌中的表达从GENT数据库中检索，并在*条形图。C*和D类，用GFP-RASSF8转染MCF-7细胞(C)和RASSF8 shRNA(D类)根据制造商的说明，通过MTT分析测定细胞活力。E类GFP-RASSF8在MCF-7细胞中体外表达，GFP-阳性细胞采用MoFlo Astrios EQ细胞分选仪（Beckman）进行分选。按照“实验程序”进行分析F类，MCF-7细胞被FLAG-E4BP4过度表达^德国用shRNA敲除RASSF8。在所有指示的转染实验中，共转染GFP（1:10比率），以分选细胞进行集落形成分析。将分选好的细胞（2500个/孔）置于六孔板上，并用G418（40μg/ml）筛选14天。菌落用结晶紫染色，并使用ImageJ软件进行计数。条形图中的值来自生物三倍（误差线±S.D.）。

**图5。**
**RASSF8诱导的细胞凋亡受E4BP4调控。** 一个在有或无FLAG-E4BP4异位表达的MCF-7细胞中进行RASSF8敲除^德国转染细胞进行annexin V染色，并用流式细胞术分析细胞凋亡状态。B类用泛酶抑制剂Z-VAD-FMK和Q-VD-OPh处理MCF-7细胞中表达的RASSF8。细胞用膜联蛋白V染色，并用流式细胞仪检测细胞凋亡状态。*条形图*s表示凋亡细胞的百分比。数值来自生物三倍体；误差线代表±S.D。C用RASSF8和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和聚ADP-核糖聚合酶的裂解状态对MCF-7细胞进行体外表达(*PARP项目*)使用指示的抗体通过蛋白质印迹进行测定。D类RASSF8在MCF-7细胞中体外表达，并使用各自的抗体通过Western blot分析测定Bcl2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白水平。E类图中显示了所示蛋白质的条带强度的-倍变化D类使用ImageJ软件将其归一化为β肌动蛋白。这个*误差条*表示三个独立实验的S.D。

**图6。**
**RASSF8的表达与原发性乳腺癌中E4BP4和组蛋白甲基转移酶的表达状态呈负相关。** 一个，从BioXpress数据库中检索RASSF8、E4BP4、G9a和SUV39H1的表达水平。在相关图中绘制了表达的-倍变化。使用GraphPad Prism计算Pearson系数，以显示乳腺癌数据集中RASSF8与E4BP4、G9a和SUV39H1表达的负相关。B类RASSF8和E4BP4的差异表达水平决定了乳腺癌患者的生存状态。Kaplan-Meier生存曲线表明RASSF8水平高的患者生存率更好，这与E4BP4表达呈负相关。

**图7。**
**提出的示意模型总结了E4BP4和表观遗传修饰物对RASSF8表达和凋亡功能的作用。** 一个在正常情况下，RASSF8的表达不会因E4BP4、G9a和SUV39H1的基础水平表达而改变。RASSF8通过调节Bcl2蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的表达来调节细胞凋亡。B类在癌症中，E4BP4、G9a和SUV39H1的异常表达促进了它们积极参与RASSF8的表观遗传抑制，并导致细胞增殖失控。

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