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.2018年2月7日；9(2):161.
doi:10.1038/s41419-017-0196-z。

癌基因HSP60调节线粒体氧化磷酸化以支持胰腺癌细胞生长过程中Erk1/2的激活

潮州 1 2, 孙洪伟 三, 陈政 1, 京高 1, 《青紫赋》 1, 胡念琪 1, 邵晓丽 1, 周莹莹 1, 熊京廷 1, 柯聂 1, 周怀滨 1, 沈丽君 1, 赫氏坊 4, 吕建新 5 6
附属公司

癌基因HSP60调节线粒体氧化磷酸化以支持胰腺癌细胞生长过程中Erk1/2的激活

潮州等。 细胞死亡病. .

摘要

HSP60是一种线粒体定位质量控制蛋白，负责维持线粒体功能。尽管HSP60被认为是不同类型癌症的抑癌基因和促癌基因，但其在人胰腺导管腺癌（PDAC）中的作用尚不清楚。在本研究中，我们证明HSP60在人类胰腺癌组织和细胞系中异常表达。对癌症基因组图谱数据库的分析表明，HSP60的表达与胰腺癌呈正相关。此外，HSP60的敲除减弱了胰腺导管癌细胞的增殖和迁移/侵袭，而HSP60异位表达增加了肿瘤的发生。通过体内致瘤性测定，我们证实HSP60促进了胰腺导管癌细胞的生长。功能分析表明，HSP60在线粒体功能调节中起着关键作用。从机制上讲，二甲双胍对HSP60的敲除和氧化磷酸化（OXPHOS）的抑制均降低了Erk1/2磷酸化并诱导凋亡和细胞周期阻滞，而EGF对Erk1/2的激活则促进了细胞增殖。有趣的是，体外补充ATP可部分恢复Erk1/2磷酸化，并通过HSP60敲除和OXPHOS抑制促进PDAC细胞的增殖。这些结果表明线粒体ATP是Erk1/2调节PDAC细胞凋亡和细胞周期的重要传感器。因此，我们的研究结果首次表明，HSP60可能是人类胰腺癌的一个新的诊断靶点，并且使用二甲双胍等药物抑制线粒体功能可能是一种针对具有HSP60/OXPHOS/Erk1/2磷酸化轴异常功能的胰腺癌细胞的有益治疗策略。

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数字

图1
图1。HSP60调节PDAC的致瘤性。
一分析TCGA数据库中四种正常胰腺组织和176例PDAC组织中HSPD1的相对表达。b条正常和肿瘤样本按组织学分级分组：G0(n个 = 4） ，G1(n个 = 31），G2(n个 = 96）和G3(n个 = 49). 该列显示了不同组织学分级的胰腺癌中HSPD1表达的点图。CC相关系数。c（c）正常胰腺和癌组织HSP60免疫组织化学（100×和400×）的代表性显微照片及其表达的定量免疫组织化学结果。d日一个典型的western blot显示HSP60蛋白在胰腺正常组织（N）和匹配的PDAC组织（T）中的表达。e、 （f）PDAC细胞系包括细胞系HSP60蛋白表达的Western blotting分析电子使用和（f）无KRAS突变。克细胞增殖和小时克隆形成分析显示热休克蛋白60shRNA-转染（shHSP60）Panc-1细胞系与对照细胞的比较。我采用跨阱法评估对照组和shHSP6060 Panc-1细胞的迁移（上面板）和侵袭（下面板）能力。j个对照细胞shHSP60 Panc-1细胞的迁移能力，以及热休克蛋白60采用创伤愈合试验对细胞进行评估。k个用shHSP60 Panc-1细胞进行肿瘤异种移植实验，并与对照细胞和挽救细胞进行比较热休克蛋白60表达式。计算各组的肿瘤体积和重量(n个 = 6） 在癌细胞注射后的指定时间，并评估差异之间的统计比较。所有量化数据均表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 ≥ 3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001
图2
图2。热休克蛋白60维持PDAC细胞的线粒体功能。
a、 b条不同细胞系的耗氧速率（OCR）的氧谱图-2k比较一控制单元和b条挽救HSP60细胞的表达。首先在基础条件下测量每个细胞系的OCR，然后依次添加寡霉素（100 μg/mL）。基底OCR；寡霉素，100存在时OCR μg/mL寡霉素；通过从基础OCR中减去寡霉素存在时的OCR，计算基础寡霉素基OXPHOS-相关OCR。c（c）线粒体ATP水平的测量。细胞与10 mM葡萄糖或5 mM 2-DG加5 mM丙酮酸测定线粒体ATP生成。显示了每个细胞系线粒体中的相对平均ATP水平。d日shHSP60 Panc-1细胞和对照细胞中的呼吸链超复合物和单复合物。电子shHSP60 Panc-1细胞和具有解救表达的细胞的呼吸链超复合体热休克蛋白60.（f）线粒体ATP水平和克在PDAC细胞系（SW1990、Patu-8988和Panc-1）和正常胰腺导管细胞（hTERT-HPNE）的细胞中测量呼吸链超复合物。小时新鲜PDAC组织样本中的呼吸链超复合物与成对正常组织中的相比。OCR和ATP生成的值被归一化为蛋白质浓度。分别用抗Grim19、抗UQCRC2、抗SDHA或抗COX1和抗cyt c探针检测络合物I（CI）、络合物II（CII）、络合物III（CIII）和络合物IV（CIV）。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 ≥ 3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001
图3
图3。热休克蛋白60与Erk1/2的磷酸化有关。
一shHSP60 Panc-1细胞和对照（Ctrl）细胞线粒体至核途径的分析。用抗P38、p-P38、Src、p-Src，Akt1、p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）、Erk1/2、p-Erk1/2，AMPKα、p-AMPK a、JNK、p-JNK和肌动蛋白抗体对细胞裂解产物进行western blot分析。b–d段所示细胞和组织中p-Erk1/2的Western blot分析：b条shHSP60 Panc-1细胞与拯救表达热休克蛋白60,c（c）来自PDAC细胞系（SW1990、Patu-8988和Panc-1）的细胞与邻近的正常胰腺导管细胞（hTERT-HPNE）的比较，以及d日新鲜PDAC组织与配对正常组织。N邻近正常组织；T肿瘤组织
图4
图4。Erk1/2磷酸化降低热休克蛋白60KD细胞由减弱的OXPHOS功能介导。
a–c抑制OXPHOS显著影响Erk1/2的磷酸化。以下因素影响的Western blot分析：一鱼藤酮对鱼藤酮（200 nM）24 h时，b条溴化乙锭（EB，线粒体DNA复制抑制剂）对经50 μg/mL EB持续6-8天，以及c（c）寡霉素对80处理细胞Erk1/2磷酸化的影响 24μM寡霉素 小时。d、 e（电子）线粒体ATP含量显著影响Erk1/2的磷酸化。Western blot分析d日、Bongkrekic acid（BKA），一种腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）抑制剂，对用BKA（0、6、8、10和12）处理的细胞中Erk1/2磷酸化的影响 μM）24 h、 和电子ATP对10处理shHSP60 Panc-1细胞Erk1/2磷酸化的影响 1和2的mM ATP 最小β-肌动蛋白用作内部对照。（f）Western blot分析用80 µM寡霉素和shHSP60 Panc-1细胞与Ctrl细胞的比较。β-肌动蛋白和VDAC分别用作细胞液和线粒体对照。克将p-Erk1/2克隆化为细胞液和线粒体。用p-Erk1/2（绿色）和线粒体（MitoTracker红色）探测Ctrl和shHSP60 Panc-1细胞。所有细胞均用DAPI（蓝色）进行背景染色。这些图像是用共焦激光显微镜拍摄的，显示了具有代表性的图像（600×）
图5
图5。二甲双胍通过减少线粒体ATP生成和随后的Erk1/2磷酸化来抑制癌细胞生长。
一线粒体ATP水平和b条用10 mM二甲双胍（Met）用于72 小时。c（c）10处理的Panc-1（Ctrl）细胞胞浆和线粒体p-Erk1/2水平的Western blot分析 mM符合72 β-肌动蛋白和VDAC分别用作细胞液和线粒体对照。d日Western blot分析Met预处理（72 h） 浓度为150时，含有或不含有ATP的Panc-1（Ctrl）细胞 nM和200 nM用于5 最小值。电子Panc-1 Ctrl细胞克隆形成分析，热休克蛋白60KD细胞和用10 mM Met和50 μM U0126用于24 小时。f、 克克隆形成分析（f） 热休克蛋白60KD和克Met-处理（10 mM）含或不含EGF的Panc-1细胞（30 ng/mL）。U0126是MAP激酶激酶MEK1和MEK2的抑制剂。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 ≥ 3). **P（P）<0.01和***P（P）<0.001
图6
图6。热休克蛋白60KD和二甲双胍可诱导PDAC细胞凋亡和细胞周期阻滞。
一DEG在热休克蛋白60KD和二甲双胍治疗（10 72 mM h） Panc-1细胞。b条使用GO数据库对4609个共享DEG进行路径富集分析。c（c）热图显示了与p-Erk1/2相关的凋亡和细胞周期基因的层次聚类热休克蛋白60KD和二甲双胍治疗（10 72 mM h） Panc-1细胞。d日显示对照Panc-1细胞HSP60蛋白水平的典型western blot，热休克蛋白60KD和二甲双胍治疗（10 72 mM h） Panc-1细胞。电子细胞周期阶段和（f）用流式细胞术检测对照Panc-1细胞的凋亡，热休克蛋白60KD和二甲双胍治疗（10 72 mM h） Panc-1细胞。该列显示的单元格百分比d日不同阶段和电子凋亡细胞（早期和晚期）的百分比。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 ≥ 3). *P（P）<0.05和***P（P）<0.001
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