Epigenetic control of influenza virus: role of H3K79 methylation in interferon-induced antiviral response

doi:10.1038/s41598-018-19370-6

.2018年1月19日；8(1):1230.

doi:10.1038/s41598-018-19370-6。

流感病毒的表观遗传控制：H3K79甲基化在干扰素诱导的抗病毒反应中的作用

附属公司

¹国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。lmarcos@cnb.csic.es。
²西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。lmarcos@cnb.csic.es。
^三国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。
⁴癌症表观遗传学和生物学项目（PEBC），Bellvitge生物医学研究所（IDIBELL），Gran Vía 199，Hospitalet de Llobregat，08908，巴塞罗那，加泰罗尼亚，西班牙。
⁵西班牙巴伦西亚Avda Fernando Abril Martorell，106，46026，卫生研究所La Fe（IISLaFe）生物标记和精密医疗单位（UByMP）。
⁶西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。
⁷西班牙加泰罗尼亚巴塞罗那大学医学与健康科学学院生理科学系。
⁸西班牙加泰罗尼亚巴塞罗那市加泰罗那研究所（ICREA）。
⁹国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。anieto@cnb.csic.es。
¹⁰西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。anieto@cnb.csic.es。

PMID： 29352168
PMCID公司：项目编号：5775356
内政部： 10.1038/s41598-018-19370-6

流感病毒的表观遗传控制：H3K79甲基化在干扰素诱导的抗病毒反应中的作用

劳拉·马科斯·维拉等。科学代表. 2018.

.2018年1月19日；8(1):1230.

doi:10.1038/s41598-018-19370-6。

附属公司

¹国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。lmarcos@cnb.csic.es。
²西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。lmarcos@cnb.csic.es。
^三国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。
⁴癌症表观遗传学和生物学项目（PEBC），Bellvitge生物医学研究所（IDIBELL），Gran Vía 199，Hospitalet de Llobregat，08908，巴塞罗那，加泰罗尼亚，西班牙。
⁵西班牙巴伦西亚Avda Fernando Abril Martorell，106，46026，卫生研究所La Fe（IISLaFe）生物标记和精密医疗单位（UByMP）。
⁶西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。
⁷西班牙加泰罗尼亚巴塞罗那大学医学与健康科学学院生理科学系。
⁸西班牙加泰罗尼亚巴塞罗那市加泰罗那研究所（ICREA）。
⁹国家生物技术中心（CNB-CSIC），达尔文3号，坎通布兰科，28049，西班牙马德里。anieto@cnb.csic.es。
¹⁰西班牙马德里Ciber de Enfermedades呼吸系统。anieto@cnb.csic.es。

PMID： 29352168
PMCID公司：项目编号：5775356
内政部： 10.1038/s41598-018-19370-6

摘要

流感病毒建立了一个病毒-宿主功能相互作用网络，该网络依赖于染色质动态，因此依赖于表观遗传修饰。通过无偏搜索，我们分析了感染引起的DNA甲基化和翻译后组蛋白修饰水平的表观遗传变化。DNA甲基化没有改变，但我们发现组蛋白乙酰化普遍减少，这与转录失活相关，并可能与导致流感病毒感染的细胞转录损伤相配合。观察到H3K79甲基化特别增加，使用特定H3K79-甲基化酶抑制剂Dot1L酶或其沉默可增加流感病毒的复制。在Dot1L下调的情况下，抗病毒反应降低，因为NF-kB复合体的核转位减少，并且检测到IFN-β、Mx1和ISG56的表达。数据表明，H3K79甲基化可以控制抗病毒信号，因此，在干扰素途径受损、Dot1L抑制的细胞中，流感病毒复制不受影响。H3K79甲基化还控制了另一种强效干扰素诱导病毒（如水泡性口腔炎病毒）的复制，但没有改变呼吸道合胞病毒的扩增，该病毒诱导干扰素信号传导较差。H3K79的表观遗传甲基化可能在控制干扰素诱导的对抗病毒病原体的信号传导中发挥重要作用。

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数字

图1
流感病毒感染改变组蛋白的翻译后修饰。A549细胞被模拟感染或PR8hv感染（m.o.i.3），在8 hpi时获得各种组分。(A类)Western blot分析显示总细胞提取物中存在PB1、PA、PB2和NP病毒蛋白以及β-微管蛋白。(B类)分离DNA并用于检测DNA甲基化。典型散点图显示模拟和流感病毒感染细胞中的CpG甲基化水平。(C类)同时，使用纳米LC-MS平台对模拟或流感病毒感染细胞的组蛋白部分进行纯化和PTM分析。修改列表示每个PTM分配的功能；乙酰化；我，甲基化。红色列（右侧）显示每个PTM相对于模拟感染细胞的PR8hv倍变化。(D类)对感染后不同时间收集的指示蛋白质进行Western blot分析。(E类，F类)纯化来自模拟或PR8hv感染细胞的组蛋白，并用于Western blot分析以检测指示的蛋白质(E类)或用于比色测定(F类)二甲基化H3K79。DNA甲基化分析重复；蛋白质组学分析一式三份。

图2
特异性抑制H3K79甲基化后，流感病毒复制增加。A549细胞被单独或用Dot1L抑制剂（Dot1L-In；1μM）电镀；48之后 h、他们在m.o.i.10感染了不同的菌株⁻³，该抑制剂在整个感染过程中都存在于处理过的细胞中。病毒滴度通过MDCK细胞在指定hpi处的斑块试验测定。A549细胞感染PR8hv和WSN(A类)，或使用CAL 04和CAL 07(B类). 在感染后的指定时间，通过MDCK细胞上的菌斑试验测定病毒滴度。学生的t吨用韦尔奇修正进行测试；进行了3个独立实验的3个技术重复。

图3
流感病毒在Dot1L下调的细胞中复制增加。用Dot1L抑制剂处理A549细胞（48 h）或用表达对Dot1L特异性shRNA的慢病毒（shDot1L1、shDot1L2）或不相关shRNA（shTM）转导（5天）。通过Western blot分析H3K79甲基化水平(A类)或比色分析(B类). 在5天内未感染或用对照或特异性Dot1L沉默剂转导的A549细胞被PR8hv感染(C类)或CAL07(D类)m.o.i.10下的菌株⁻³在指定的hpi下，通过MDCK细胞上的斑块试验测定病毒滴度。学生的t吨用韦尔奇修正进行测试；进行了3个独立实验的3个技术重复。

图4
Dot1L抑制剂治疗可减少NF-κB的核转位。(A类)A549细胞单独或用Dot1L抑制剂（1μM）电镀；48 h后，添加TNFα（10 ng/ml，30 最小值）。使用抗层粘连和-p65抗体对细胞进行免疫荧光处理。(B类)PR8hv感染细胞（m.o.i.3，8 h）部分使用或不使用Dot1L抑制剂(A类). 在整个实验过程中，处理过的细胞中都存在抑制剂。使用抗NP、-层粘连蛋白和-p65抗体对细胞进行免疫荧光处理。通过正交投影图像分析测量核NF-κB易位，并在至少200个细胞/条件下进行量化。计算不同条件下每个细胞细胞核和细胞质中p65相对强度的比值。比率显示在每个实验的代表图像下方的色散图中。进行了三个独立的实验。

图5
Dot1L下调降低NF-κB的核转位。A549细胞被用作对照，或用表达无关shRNA（TM）或特异性Dot1L沉默子（shDot1L1，shDot1L2）的慢病毒转导。5天后，添加TNFα（10 ng/ml，30 最小值）。使用抗层粘连蛋白A/C和-p65抗体对细胞进行免疫荧光处理。(B类)细胞按中的方式处理(A类)和PR8hv感染（m.o.i.3，8 h） ●●●●。使用抗NP、-层粘连蛋白和-p65抗体进行免疫荧光分析。进行了三个独立的实验。

图6
H3K79甲基化控制抗病毒反应。A549细胞单独或用Dot1L抑制剂（Dot1L-In，1μM，48 h）然后不治疗(A类)，用100 U/ml干扰素αβ处理(B类)或PR8hv感染（1个PFU/细胞）(C类)在8或16期间 h.提取RNA并用于干扰素β、ISG56和MX1基因的qPCR检测。干扰素αβ治疗被用作阳性对照，并诱导分析的基因显著增加（***P < 0.001). 学生的t吨用韦尔奇修正进行测试；进行了3个独立实验的3个技术重复。

图7
H3K79甲基化参与干扰素对流感病毒的反应。MDCK、MDCK V2或MDCK Npro细胞单独或与Dot1L抑制剂（1μM，48 h），然后感染（m.o.i.10⁻³)带PR8hv(A类)或CAL 07(B类). 通过不同hpi下MDCK细胞的斑块试验测定病毒滴度。在所有情况下，在整个实验过程中，处理细胞中都存在抑制剂。(C类)MDCK、MDCK V2或MDCK Npro细胞单独或与Dot1L抑制剂（1μM，48 h），然后感染PR8hv（1个PFU/细胞）。在指定的hpi，提取RNA并用于干扰素β、ISG56和MX1基因的qPCR检测。学生的t吨用韦尔奇修正进行测试；进行了3个独立实验的3个技术重复。

图8
H3K79甲基化调节干扰素诱导病毒的复制。A549细胞单独或与Dot1L抑制剂（1μM，48 h）(A类，C类))或用表达对照shRNA（TM）的慢病毒或特异性Dot1L沉默子转导（shTM，shDot1L 1，shDot1L 2，5天）(B类，D类). 之后，细胞感染RSV（m.o.i.1）(A类，B类)或VSV（m.o.i.10^-3) (C类，D类). 在整个实验过程中，处理过的细胞中都存在抑制剂。右侧面板显示了病毒蛋白的相应表达以及通过Western blot分析测量的指示蛋白。在感染后的指定时间，通过菌斑试验测定病毒滴度。学生的t吨韦尔奇校正测试；进行了3个独立实验的3个技术重复。

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1. Esteller M.癌症表观基因组学：DNA甲基体和组蛋白修饰图谱。Nat Rev基因。2007;8:286–298. doi:10.1038/nrg2005。-内政部-公共医学
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