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.2018年1月4日；16（1）：1。
doi:10.1186/s12915-017-0471-6。

二甲基果酸硫铈促进淋巴管内皮细胞对结核分枝杆菌胞浆和胞内负荷的获取

托马斯·勒纳 1, 克里斯托夫·奎瓦尔 1, 安东尼·费恩斯 1, 乌尔斯卡·雷普尼克 2, 加雷思·格里菲斯 2, 马克西米利亚诺·古铁雷斯 三
附属公司

二甲基果酸硫铈促进淋巴管内皮细胞对结核分枝杆菌胞浆和胞内负荷的获取

托马斯·勒纳等。 BMC生物. .

摘要

背景：结核分枝杆菌（Mtb）复合物毒力成员的外表面发现的糖脂，即硫铈醇二密角酸酯（PDIM），是导致Mtb发病的主要因素。骨髓细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，是感染后结核分枝杆菌的主要宿主，以前的研究表明PDIM在支持这些细胞中的结核分枝杆菌方面发挥着多种作用。然而，结核分枝杆菌可以感染其他类型的细胞。我们之前的研究表明，结核分枝杆菌在人类淋巴管内皮细胞（hLECs）中有效复制，并且hLEC胞浆充当人类结核分枝杆菌的储存库。在这里，我们研究了PDIM在结核分枝杆菌易位到hLECs胞浆中的作用。

结果：对一个不能产生PDIM的结核分枝杆菌突变株的分析表明，细菌与膜损伤标记Galectin-8（Gal8）的共定位较少，这表明PDIM对吞噬体膜损伤有很大的作用。缺乏这种结核分枝杆菌脂类还导致结核分枝杆菌与细胞内细菌宏自噬清除标记物（吞噬）共定位的比例降低，如泛素、p62和NDP52。hLEC成像和透射电子显微镜显示，缺乏PDIM的Mtb突变体很少定位在胞浆中，导致较低的细胞内负荷。

结论：PDIM用于破坏hLEC中的吞噬体膜，帮助结核分枝杆菌避免水解的吞噬体环境。它有助于Mtb转移到胞浆中，缺乏PDIM的Mtb的胞内负荷减少表明胞浆是这些细胞中Mtb首选的复制生态位。我们假设，靶向Mtb中PDIM合成的药理作用将减少人类Mtb淋巴储库的形成。

关键词：细胞溶胶；淋巴内皮细胞；巨噬细胞；结核分枝杆菌；PDIM；吞噬体损伤；硫铈二长铈酸酯；结核病；色诺芬奇；hLEC公司。

PubMed免责声明

利益冲突声明

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

施普林格自然公司在公布的地图和机构隶属关系中的管辖权主张保持中立。

数字

图1
图1
PDIM有助于吞噬体损伤，并有助于避免hLECs中的吞噬溶酶体命运，hLECs被Mtb-WT、MtbΔPDIM或MtbΔPDIM:：PDIM（所有GFP标记）感染5小时后，任何未被吞噬的细菌被冲走。固定前感染持续2、24、48或72小时。使用抗体对样本进行免疫荧光标记(一)半乳糖凝集素8（Gal8）或(c（c）)组织蛋白酶D（CtsD）。使用DAPI对细胞核进行可视化。白色方框勾勒出荧光通道单独显示的缩放区域。比例尺为10μm。图片是5处样本的代表性示例 + 24马力。图像，如中的(一)以及(c（c）)使用ImageJ量化(b条)Gal8或(d日)每个时间点的每个Mtb菌株的CtsD。显示了在每种条件下对标记物[定义为在与单个Mtb颗粒（绿色通道）重叠的区域中具有至少100的平均像素强度的标记物（红色通道）]呈阳性的Mtb的百分比。每个重复每个样品至少成像六个视野，并执行三个独立的重复。还显示了每个条件下分析的Mtb颗粒总数(N个). 总体平均值用代表平均值标准误差的误差条表示。使用单向方差分析和Tukey后验确定统计显著性。CtsD组织蛋白酶D、Gal8半乳糖凝集素8、GFP绿色荧光蛋白、人淋巴内皮细胞hLEC、感染后hpi小时、结核分枝杆菌结核分枝杆菌，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型***第页 < 0.001
图2
图2
PDIMs对人类淋巴管内皮细胞中NF-kB或IRF-1的激活没有差异性影响，这些细胞在任何非吞噬细胞细菌被冲走之前，感染了Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM（所有GFP标记）5小时。固定前感染持续24小时。使用抗p65（NF-kB）或IRF-1抗体对样本进行免疫荧光标记。用DAPI对细胞核进行可视化。一感染细胞的典型图像。白色星号表示感染细胞有核移位。感染NF-kB的细胞百分比(b条)或IRF-1(c（c）)核定位。对至少100个感染细胞进行计数，并进行三个独立的重复。平均值用代表平均值标准误差的误差条显示。使用单向方差分析和Tukey后验确定统计显著性。GFP绿色荧光蛋白结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型
图3
图3
当缺乏PDIM时，人类淋巴管内皮细胞中Mtb的异种吞噬标记物招募受损。三种与吞噬有关的蛋白质的免疫荧光定量分析：一泛素（Ub），b条第62页和c（c）NDP52.感染、免疫荧光标记、成像和定量的过程与图1所示相同。每个重复每个样品至少成像六个视野，并执行三个独立的重复。还显示了每个条件下分析的Mtb颗粒总数(N个). 总体平均值用代表平均值标准误差的误差条表示。使用单向方差分析和Tukey后验确定统计显著性。结核分枝杆菌结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，Ub泛素，WT野生型***第页 < 0.001, *第页 < 0.05
图4
图4
电子显微镜分析。缺乏PDIM的结核分枝杆菌在胞浆中的出现频率要低得多。用Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM感染人淋巴内皮细胞5次 + 24小时并固定。对样品进行树脂包埋处理，然后使用透射电子显微镜观察结核分枝杆菌的亚细胞定位。考虑并分类了三个潜在的位置。a–c细胞溶胶（定义为在表面可见的细菌囊样物质外，细菌周围没有明显的宿主膜）。d日–（f）吞噬体（定义为封闭在单个膜结合细胞器中的细菌）。其中大多数是较大的（膜结合的）液泡，通常有一个以上的结核分枝杆菌细胞，以及在不同降解阶段的额外不规则膜和内容物，典型的吞噬体。箭头表示吞噬体/吞噬溶酶体限制膜。克–我自噬。在这种情况下，细菌和周围的细胞质被一层或多层膜所包围，这些膜大多保存不良。与吞噬体相反，自噬体的内部内容物似乎没有被降解。此处的箭头表示结构外围的膜或膜残留物不太可见。在所有的图像中，黑色恒星表示细菌。比例尺为500纳米。j个进行体视学分析以确定每个隔室中结核分枝杆菌的比例。数据是两个独立实验的代表，每个条件下至少分析32个感染细胞。结核分枝杆菌结核分枝杆菌，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型
图5
图5
人类淋巴内皮细胞中缺乏PDIM的结核分枝杆菌的细胞内负荷严重降低。一每个时间点感染Mtb-WT、MtbΔPDIM或MtbΔPDIM:：PDIM的人淋巴管内皮细胞的代表性图像。此外，MtbΔPDIM的感染率是正常MOI的10倍，以过度补偿该菌株吞噬细胞摄取的减少。b条使用ImageJ测量每个菌株的吞噬细胞摄取量，方法是绘制每个细胞在5℃时的总GFP信号（称为RAWIntDen） + 2马力。每个重复至少分析六个视野，执行三个独立的重复。每个细胞的总体平均GFP显示为具有表示平均值的标准误差的误差条。使用单向方差分析和Tukey的后验来测试每个菌株的平均值之间的差异。c（c）每细胞GFP的测量方法与(b条)除了比较每个菌株的每个时间点（即细菌复制）。GFP绿色荧光蛋白，感染后hpi小时，MOI感染多重性，结核分枝杆菌结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型***第页 < 0.001, *第页 < 0.05
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