EWS-FLI-1 creates a cell surface microenvironment conducive to IGF signaling by inducing pappalysin-1

doi:10.18632/genesandcancer.159

。2017年11月；8(11-12):762-770.

doi:10.18632/基因和癌症.159。

EWS-FLI-1通过诱导pappalysin-1创造有利于IGF信号传导的细胞表面微环境

潘内塞尔瓦姆·贾亚巴尔¹, 彼得·霍顿^1 2 三, Yuzuru Shiio公司^1 2 4

附属机构

¹美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心Greehey儿童癌症研究所。
²美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心。
^三美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心分子医学系。
⁴美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心生物化学系。

PMID： 29321818
预防性维修识别码：项目编号：5755722
内政部： 10.18632/基因和癌症159

EWS-FLI-1通过诱导pappalysin-1创造有利于IGF信号传导的细胞表面微环境

Panneerselvam Jayabal公司等。基因癌症。 2017年11月。

。2017年11月；8(11-12):762-770.

doi:10.18632/基因和癌症.159。

作者

潘内塞尔瓦姆·贾亚巴尔¹, 彼得·霍顿^1 2 三, Yuzuru Shiio公司^1 2 4

附属机构

¹美国得克萨斯州圣安东尼奥市得克萨斯大学健康科学中心格里希儿童癌症研究所。
²美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心。
^三美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心分子医学系。
⁴美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心生物化学系。

PMID： 29321818
预防性维修识别码：项目编号：5755722
内政部： 10.18632/基因和癌症159

摘要

尤因肉瘤是儿童侵袭性骨和软组织癌，预后不良。其特征是EWS和Ets家族转录因子（最常见的是FLI-1）之间的染色体易位。EWS-FLI-1融合占尤因肉瘤病例的85%。EWS-FLI-1调节许多对肉瘤形成重要的基因的表达，可以转化NIH3T3和C3H10T1/2细胞，对尤因肉瘤细胞的增殖和致瘤性是必要的，表明EWS-FLI-1是引起肿瘤的蛋白。在这里，我们报道EWS-FLI-1诱导pappalysin-1（PAPPA）的表达，PAPPA是一种细胞表面蛋白酶，可降解IGF结合蛋白（IGFBP）并提高IGF的生物利用度。EWS-FLI-1与pappalysin-1基因启动子结合，刺激pappallysin-1的表达，导致IGFBP降解和IGF信号增强。pappalysin-1的沉默强烈抑制了凤尾鱼依赖性和凤尾鱼非依赖性生长以及尤因肉瘤细胞的异种移植致瘤性。这些结果表明，EWS-FLI-1通过诱导pappalysin-1创造了一个有利于IGF信号传导的细胞表面微环境，pappalysin-1是抑制尤因肉瘤IGF信号传递的新靶点。

关键词：EWS-FLI-1；尤因肉瘤；IGF信号；IGFBP；pappalysin-1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明，与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。

数字

**图1。EWS-FLI-1诱导pappalisin-1表达**
（A） shRNA介导的A673尤因肉瘤细胞中EWS-FLI-1的沉默。用表达针对FLI-1 C末端区域shRNA的慢病毒或荧光素酶（对照）感染A673细胞，并用2µg/ml嘌呤霉素筛选2天。制备全细胞裂解物，并使用针对FLI-1 C末端和微管蛋白的抗体进行免疫印迹（负载控制）。（B） EWS-FLI-1沉默后A673细胞分泌体中pappalysin-1蛋白水平降低。（C） A673细胞中EWS-FLI-1沉默导致pappalysin-1转录水平降低。如（A）所示，沉默EWS-FLI-1，并通过实时PCR检测pappalysin-1 mRNA水平。星号表示与荧光素酶shRNA表达细胞相比p<0.05。（D）人类间充质干细胞中EWS-FLI-1的表达导致pappalysin-1转录水平升高。用表达EWS-FLI-1的慢病毒或空载体感染人类间充质干细胞，并用2µg/ml嘌呤霉素筛选2天。实时PCR检测pappalysin-1 mRNA水平。星号表示与表达载体的细胞相比p<0.05。

**图2。EWS-FLI-1与尤因肉瘤细胞中pappalysin-1基因启动子结合**
通过染色质免疫沉淀法在A673和EW8尤因肉瘤细胞中检测EWS-FLI-1与pappalysin-1启动子的结合。使用两对不同的引物（#1和#2）扩增1、2和3kb上游区域。EWS-FLI-1沉默验证了结合的特异性。EZH2[37]和NR0B1[38]是已知的EWS-FLI-1目标。GAPDH作为阴性对照。

**图3。尤文肉瘤肿瘤和细胞系中Pappalysin-1 RNA的表达**
采用实时PCR检测7例尤因肉瘤肿瘤样本、4例尤因肉瘤细胞系、人类间充质干细胞和人类正常扁桃体样本中pappalysin-1 mRNA的表达。所有RNA水平均归一化为人类间充质干细胞中的RNA水平。

**图4。Pappalysin-1沉默导致尤文肉瘤细胞中IGFBP的积累和IGF信号的减少**
（A）在四种尤因肉瘤细胞系（A673、EW8、TC32和TC71）中，siRNA转染沉默了Pappalysin-1的表达。使用抗IGFBP2、IGFBP4、IGFFP5、PGK1、pappalysin-1、IGF-1R、phospho-IGF-1R（在酪氨酸1135处磷酸化）、phosphal-Akt（在丝氨酸473处磷酸化的）和tubulin的抗体进行免疫印迹。（B） EWS-FLI-1沉默概述了pappalysin-1在尤因肉瘤中的沉默作用。靶向A673和EW8细胞中FLI-1的C末端区域的shRNA沉默了EWS-FLI-1表达。使用抗IGFBP2、IGFBP4、IGFFP5、PGK1、pappalysin-1、FLI-1（C末端）、IGF-1R、磷酸化IGF-1R（在酪氨酸1135磷酸化）、磷酸化Akt（在丝氨酸473磷酸化）和微管蛋白的抗体进行免疫印迹。（C） pappalysin-1抑制剂stanniocarin 1和2（STC1和STC2）的表达概括了pappallysin-1在尤因肉瘤中的沉默作用。通过慢病毒感染和嘌呤霉素选择，C-末端FLAG标记的STC1和STC2在A673细胞中稳定表达。使用抗IGFBP2、IGFBP4、IGFFP5、PGK1、pappalysin-1、IGF-1R、phospho-IGF-1R（在酪氨酸1135处磷酸化）、phosphal-Akt（在丝氨酸473处磷酸化的）和tubulin的抗体进行免疫印迹。

**图5。Pappalysin-1沉默导致尤因肉瘤分泌组中生物活性IGF-1水平降低**
如图4A所示，在A673和EW8细胞中沉默Pappalysin-1，并使用生物活性IGF-1 ELISA测定游离生物活性IGF1的水平。星号表示与对照siRNA转染细胞相比p<0.05。

**图6。Pappalysin-1沉默抑制*在体外*和体内尤因肉瘤细胞的生长**
（A）在A673和EW8细胞中通过siRNA和shRNA沉默pappalysin-1。（B） Pappalysin-1沉默抑制尤因肉瘤细胞增殖。通过siRNA或shRNA沉默Pappalysin-1，并使用IncCyte活细胞成像系统评估细胞增殖。（C）重组pappalysin-1蛋白挽救了pappalysin-1沉默诱导的生长停滞。siRNA转染16小时后，将重组pappalysin-1蛋白以500 ng/ml的速度添加到培养基中，并通过IncuCyte系统评估细胞增殖。（D）表达pappalysin-1 shRNA的A673细胞的结晶紫染色或控制混乱的shRNA。（E）pappalysin-1沉默抑制Ewing肉瘤细胞的锚定非依赖性生长。A673和EW8细胞感染了针对pappalysin-1或对照扰乱shRNA表达shRNA的慢病毒，并用2µg/ml嘌呤霉素进行筛选。感染四天后，将细胞置于半固体培养基中。培养三周后，对菌落进行计数并拍照。星号表示与对照shRNA-表达细胞相比p<0.05。（F） Pappalysin-1沉默抑制尤因肉瘤细胞的异种移植致瘤性。A673和EW8细胞感染表达pappalysin-1 shRNAs的慢病毒或对照干扰shRNA，并用2µg/ml嘌呤霉素筛选2天。将每种细胞类型皮下注射到SCID小鼠（2×10⁶细胞/注射，n=5）。每周用卡尺监测肿瘤生长。注射后5周解剖肿瘤的照片显示在顶部。。

**图7。尤因肉瘤中pappalysin-1刺激IGF信号的模型**
EWS-FLI-1直接激活pappalysin-1的表达，从而裂解IGFBP并增加细胞表面附近的生物活性IGF水平，从而增强IGF信号传导和增殖。

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