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。2017年11月10日8:1468。
doi:10.3389/fimmu.2017.01468。 2017年电子收集。

纯化水果菠萝蛋白酶抑制上皮TNF-α受体改善结肠炎肠道炎症和屏障功能障碍

周子娟 1, 王亮（Liang Wang） 1, 潘潘峰 1, 连红饮 2, 陈旺 三, 盛旭志 三, 董建义 1, 王靖宇 1, 袁琳 2, 陈大鹏 1, 熊永健 4 5, 彭金勇 2
附属公司

纯化水果菠萝蛋白酶抑制上皮TNF-α受体改善结肠炎肠道炎症和屏障功能障碍

周子娟等。 前部免疫。 。

勘误表in

摘要

TNF-α受体（TNFR）的激活导致炎症反应，抗TNF治疗已用于减轻炎症性肠病（IBD）的炎症症状和治愈粘膜溃疡。菠萝蛋白酶是一种蛋白水解酶的复杂天然混合物，已被证明具有抗炎作用。本研究旨在探讨纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）对大鼠结肠炎模型上皮TNFR的抑制作用。通过结肠内注射2，4，6-三硝基苯磺酸建立结肠炎。通过定量RT-PCR和western blotting检测TNFR1和TNFR2的表达。通过检测炎症反应和肠上皮屏障功能来评估PFB对结肠炎的影响。我们的结果表明，在结肠炎模型中，TNFR1和TNFR2的表达均显著增加，PFB可显著逆转这种增加。PFB显著改善了结肠炎症状，包括炎症细胞浸润、细胞因子谱、上皮细胞凋亡和上皮紧密连接屏障功能障碍。与果实菠萝蛋白酶和茎菠萝蛋白酶复合物相比，PFB对TNFR2的抑制作用强于TNFR1。这些结果表明，PFB对TNFR2的选择性抑制作用强于TNFR1。换句话说，水果菠萝蛋白酶的纯化提高了其对TNFR2抑制的选择性。PFB显著抵消了结肠炎中上皮TNFRs的高表达，PFB诱导的TNFR抑制改善了结肠炎症状。这些结果为PFB潜在的IBD治疗提供了新的见解。

关键词：TNF-α受体；菠萝蛋白酶；细胞因子；炎症；炎症性肠病；肌球蛋白轻链激酶；净化；紧密连接。

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数字

图1
图1
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）对正常细胞和大鼠的毒性。（A）采用MTT法研究了PFB对肠上皮细胞株IEC-6的细胞毒性。大鼠灌胃给予PFB，每日一次，连续14天(n个 = 6). 结肠细胞因子TNF-α的表达水平（B），IL-1β（C）和IL-8（D）通过酶联免疫吸附试验检测TNFR1和TNFR2 mRNA和蛋白的表达水平（E，F）分别通过定量实时PCR和western blotting检测(n个 = 6). 数据表示为平均值 ± SD。正常控制（NC）组中的值设置为100%，其他值是相对于NC组给出的。
图2
图2
精制水果菠萝蛋白酶（PFB）缓解结肠炎症状。14天后检查结肠炎症状 PFB治疗天数。（A）大鼠结肠组织苏木精伊红染色（20×，比例尺为100 微米）。PFB对（B）体重，（C）食物摄入，（D）宏观可见损伤，以及（E）结肠炎大鼠结肠重量长度比。假手术组的数据设置为100%的相对值，并表示为平均值 ± SD。其他数据是与sham相比的相对值：**P（P） < 与假手术组比较0.01(n个 = 6只大鼠）；##P（P） < 与TNBS对照组相比0.01(n个 = 6只大鼠）。SASP、柳氮磺胺吡啶。
图3
图3
纯化的水果菠萝蛋白酶（PFB）减弱了中性粒细胞浸润和细胞因子谱。PFB对（A）髓过氧化物酶（MPO），（B）肿瘤坏死因子-α，（C）IL-1β，和（D）酶联免疫吸附法测定大鼠结肠组织中的IL-8。数据表示为平均值 ± SD**P（P） < 与假手术组比较0.01；##P（P） < 与TNBS对照组相比0.01(n个 = 6只大鼠）。SASP、柳氮磺胺吡啶。
图4
图4
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）逆转了增加的肠道通透性。14岁之后 在PFB治疗的第天，通过检测血清中FD-4的回收率来检查各组的肠道通透性体内 （A）Caco-2细胞的跨上皮电阻（TER）（B）(n个 = 6). 细胞与100 纳克/毫升脂多糖（LPS）24 h在存在或不存在PFB的情况下。假手术组或正常对照（NC）细胞组的数据设置为100%的相对值，并表示为平均值 ± SD。其他数据是与sham或NC相比的相对值：**P（P） < 与假手术组或NC组比较0.01；##P（P） < 与TNBS对照组或LPS对照组比较，0.01。
图5
图5
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）诱导结肠炎疗效的潜在机制。14天后分离结肠段 PFB治疗天数。TNF-α受体（TNFR）mRNA的实时定量PCR分析（A）; TNFR蛋白的免疫印迹分析（B–D），炎症标记物NF-κB（B、E），紧密连接屏障相关蛋白肌球蛋白轻链激酶（MLCK）（B、F）和（B、G），凋亡相关蛋白Bax（B、H）和Bcl-2（B、I）数据表示为平均值 ± SD。假手术组的值设置为100%，其他值相对于假手术组给出：**P（P） < 与假手术组比较0.01；#P（P） < 0.05和##P（P） < 与TNBS对照组相比0.01(n个 = 6只大鼠）。
图6
图6
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）中TNFR2的下调诱导的炎症抑制和上皮屏障功能障碍。在靶向TNFR2的siRNA存在下，PFB对TNFR2、NF-κB和MLCK表达的影响。（A）PFB对TNFR2、NF-κB和MLCK表达影响的典型Western blotting图像；PFB对TNFR2表达的统计分析（B），核因子-κB（C）和MLCK（D）PFB对NF-κB和MLCK影响的典型Western blotting图像。数据表示为平均值± SD。数值是相对于si-control（100%）中的正常对照（NC）给出的，其他数值是相对于NC组给出的：**P（P） < 与NC相比为0.01；##P（P） < 与相应的LPS对照组相比为0.01。
图7
图7
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）中TNFR1的下调导致炎症抑制和上皮屏障功能障碍。在靶向TNFR1的小干扰RNA存在下，PFB对NF-κB和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）表达的影响。数据表示为平均值 ± SD。数值是相对于LPS治疗组（对照组，100%）给出的，其他数值是相对于对照组给出的：**P（P） < 与LPS对照组相比为0.01。
图8
图8
纯化水果菠萝蛋白酶（PFB）与菠萝蛋白酶复合物的比较研究。纯化PFB效果的Western blotting分析（A），茎菠萝蛋白酶复合物（B）和水果菠萝蛋白酶复合物（C）TNFR1和TNFR2的蛋白表达。数据表示为平均值 ± 标准差。正常控制（NC）组的值设置为100%，其他值相对于NC组的值给出：**P（P） < 与NC组比较0.01；#P（P） < 0.05和##P（P） < 与LPS对照组比较0.01；&&P（P） < 与所示相比为0.01(n个 = 6个实验）。
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