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.2017年10月30日10:346。
doi:10.3389/fnmol.2017.00346。 2017年电子收集。

BDNF/trkB通过钙诱导钙瞬变v（v）2.2运动神经元中的钙通道与β2-链层粘连蛋白上的F-actin组装和生长锥形成相对应（221）

本杰明·多姆伯特 1, 斯蒂芬妮·巴尔克 1, 帕特里克·吕宁施（Patrick Lüningschrör） 1, 梅赫里·莫拉迪 1, 拉杰夫·西瓦达桑 1, 莱娜·萨尔·鲍尔恩舒伯特 1, 西比尔·贾布隆卡 1
附属公司

BDNF/trkB通过钙诱导钙瞬变v（v）2.2运动神经元中的钙通道与β2-链层粘连蛋白上的F-actin组装和生长锥形成相对应（221）

本杰明·多姆伯特等。 前臼齿神经科学. .

摘要

自然钙2+初级运动神经元的瞬变和肌动蛋白动力学与细胞分化（如轴突伸长和生长锥形成）相对应。脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体trkB支持运动神经元存活和突触分化。然而，在运动神经元中，BDNF/trkB信号对自发Ca的影响2+轴突生长锥的内流和肌动蛋白动力学尚未完全阐明。在我们的研究中，我们解决了神经营养因子信号如何与细胞自主兴奋性和生长锥形成相对应的问题。将小鼠胚胎的初级运动神经元培养在突触特异的、含有β2链的层粘连蛋白亚型（221）上，该亚型通过自发钙离子调节轴突伸长2+N型特异性电压门控钙离子的增强聚集所引发的瞬态2+通道（Cav（v）2.2）在轴突生长锥中。TrkB-缺乏(trk英国电信公司-/-)不表达全长trkB受体的小鼠运动神经元和未培养BDNF的野生型运动神经元的自发钙降低2+与轴突伸长改变和生长锥形态缺陷相对应的瞬态，伴随着局部肌动蛋白细胞骨架的改变。反之亦然急性应用BDNF导致自发Ca的诱导2+瞬态和Cav（v）2.2运动生长锥中的聚集，以及通过LIM激酶途径和Tyr129处profilin磷酸化促进β-actin稳定的trkB下游信号级联的激活。最后，我们确定了培养在层粘连蛋白221/211上的胚胎运动神经元的轴突生长锥中神经元兴奋性和肌动蛋白动力学的相互调节。兴奋性受损导致轴突伸展和局部肌动蛋白细胞骨架失调，而β-肌动蛋白击倒钙v（v）2.2聚类受到影响。我们从我们的数据中得出结论，在胚胎运动神经元中，BDNF/trkB信号通过改变局部肌动蛋白细胞骨架并伴随钙的增加，促进轴突伸长和生长锥的形成v（v）2.2聚集和局部钙瞬变。这些发现可能有助于探索胚胎运动神经元成熟过程中可能失调导致运动神经元疾病的细胞机制。

关键词：BDNF；第2.2节；肌动蛋白；生长锥；运动轴突；trkB。

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数字

图1
图1
钙的减少v（v）2.2累积和自发钙2+生长锥的瞬变trk英国电信公司−/−运动神经元对应于层粘连蛋白221上轴突生长的改变。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的野生型运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF和CNTF在场的情况下。TrkB受体（绿色）和Cav（v）2.2钙通道（洋红色）紧密定位于生长锥突起，以白色箭头突出显示（比例尺：5μm）。（B）在trk英国电信公司−/−生长锥Cav（v）2.2积累（品红色）在生长锥顶端受到影响，而tau水平（绿色）没有改变（比例尺：5μm）。钙的统计分析v（v）2.2免疫反应性trk英国电信公司−/−轴突生长锥（0.54±0.1，Q20.47,n个= 4,N个=66）与野生型对照（1.00±0.04，Q21.01,n个= 6,N个=78）显示出显著差异(第页= 0.0015). 通过将Ca归一化，也得到了类似的结果v（v）2.2针对内部参考蛋白tau(trk英国+/+1.00±0.08，Q20.95;trk英国−/−0.65±0.06，Q20.67;第页=0.0118）（C）结构表型伴随着对照组和对照组之间自发钙瞬变频率的显著差异trk英国电信公司−/−生长锥（对照0.92±0.13，Q20.60，N个= 72;trk英国电信公司−/−0.55±0.09，Q20.30,N个= 64;第页= 0.0337). 控制的代表性记录（上轨迹、蓝色箭头）和trk英国电信公司−/−当trkB信号受损时，生长锥显示钙尖峰数量减少。（D）野生型和trk英国−/−运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天在体外在BDNF和CNTF存在下，并针对tau染色（比例尺：150μm）。TrkB突变细胞（316.4±12.65μm，Q2314.5微米，n个= 7,N个=298）比对照组轴突长（262.9±11.79μm，Q2278.8微米，n个= 7,N个= 283,第页= 0.0093)（E）用30 nMω-芋螺毒素（CTX）处理后，野生型运动神经元的轴突伸长增加，但在trk英国电信公司−/−细胞。
图2
图2
BDNF对Ca是必需的v（v）2.2累积和局部Ca2+层粘连蛋白221上运动轴突生长锥的瞬变。（A）野生型运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天的轴突生长锥图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，对跨膜蛋白APP（绿色）和Ca进行染色v（v）2.2（品红色）（比例尺：5μm）。含CNTF或GDNF-Cav（v）与BDNF相比，2.2信号显著减少（BDNF 1.00±0.11，Q21.00,n个= 5,N个=130；CNTF 0.65±0.05，Q20.65,n个= 6,N个=133；GDNF 0.47±0.04，Q20.47,n个= 6,N个= 145; p（B-C）=0.0081，p（B-G）=0.0002），尤其是在轴突末端突起处，而APP免疫反应没有降低。通过对Ca进行归一化处理，获得了类似的结果v（v）2.2针对内部参考蛋白APP的强度。（B）与BDNF处理的运动神经元相比，CNTF和GDNF处理细胞显示自发Ca的频率降低2+相应生长锥的瞬态（BDNF 0.89±0.11，Q20.6,N个=75；CNTF 0.69±0.13，Q20.3,N个= 77; GDNF 0.50±0.08，Q20.3,N个= 73; p（B-C）=0.0306，p（B-G）=0.0078）。（右面板）与BDNF（蓝色）、CNTF（洋红色）或GDNF（绿色）培养的运动神经元轴突生长锥的代表性记录，显示钙尖峰。（C）运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，并对τ进行染色（比例尺：150μm）。两种CNTF-（466.6±35.41μm，Q2465.6微米，n个= 6,N个=263）和GDNF处理（454.8±19.28μm，Q2440.9微米，n个= 6,N个与BDNF处理的细胞（356±22.16μm，Q2342微米，n个= 6,N个= 275).
图3
图3
BDNF信号足以诱导Cav（v）2.2聚类和局部Ca2+层粘连蛋白-221上胚胎运动神经元生长锥突起处的瞬变。（A）层粘连蛋白-221/211上非脉冲和BDNF脉冲轴突生长锥的轴突生长锥的代表性图像，对Ca染色v（v）2.2（洋红色）和APP（绿色）（比例尺：5μm）。BDNF脉冲Cav（v）2.2个通道聚集在生长锥尖端，如白色箭头所示。在非脉冲条件下钙的潜在积累v（v）如白色圆圈所示，在中央生长锥区域检测到2.2个通道。钙v（v）2.2水平显示BDNF脉冲显著增加（无脉冲1.00±0.04，Q21.00,n个= 9,N个= 221; 5′BDNF 1.93±0.24，Q21.75，n个= 9,N个= 245;第页= 0.0014). 钙的比率v（v）2.2和APP免疫反应结果相似。（B）BDNF治疗后的这些结构变化与自发钙离子频率显著增加相匹配2+与非脉冲控制相比的瞬态（无脉冲0.16±0.08，Q20，IQR 0，N个= 32; 5′BDNF 0.30±0.08，Q20，IQR 2，N个= 32;第页= 0.0104). （右面板）在BDNF脉冲之前和之后2分钟，对相同的生长锥进行成像。非脉冲和BDNF脉冲示踪的代表性记录显示钙的数量增加2+响应BDNF的尖刺（洋红色箭头）。在BDNF后，钙尖峰的总数几乎翻了一番，并且每次记录至少显示一个尖峰的活性生长锥的百分比大大增加。（C）非脉冲和BDNF-脉冲的代表性图像trk英国+/+和trk英国−/−钙染色生长锥v（v）2.2（品红色）和突触素（绿色）（标尺：5μm）。在野生型细胞中，BDNF的急性应用导致Ca增加v（v）2.2生长锥突起处的免疫反应（以白色箭头表示）。此效果在中不可见trk英国电信公司−/−轴突生长锥，其中Cav（v）2.2免疫反应主要发生在中央生长锥区，如白色圆圈所示。突触体素作为内部参考蛋白在每种情况下都具有可比性。（右面板）统计显著性由BDNF脉冲与非脉冲生长锥的比率决定trk英国电信公司+/+和trk英国−/−运动神经元与钙的关系v（v）仅2.2(trk英国+/+1.00±0.06，Q21.00,n个=7，N（无脉冲）=88，N（5′BDNF）=102；trk英国−/−0.75±0.07，Q20.79,n个=7，N（无脉冲）=100，N（5′BDNF）=106；第页=0.0184）和Cav（v）2.2根据突触素标准化的信号强度强调了trk英国电信公司−/−生长锥对急性BDNF的应用。
图4
图4
层粘连蛋白-221对胚胎运动神经元轴突生长锥中神经元兴奋性和β-肌动蛋白存在的相互调节。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元生长锥的代表性图像在体外使用或不使用30 nM CTX，并对β-肌动蛋白（绿色）和τ（洋红色）进行染色（比例尺：5μm）。CTX处理的运动神经元发育出较小的生长锥（对照组26.14±1.13μm2，Q225.4微米2,n个= 13,N个= 226; 30 nM CTX 19.51±1.17μm2，Q219.96微米2,n个= 17,N个= 274;第页=0.0005），β-肌动蛋白缺陷（对照组1.00±0.05，Q21.00; 30 nM CTX 0.71±0.07，Q值20.68;第页= 0.0037). Tau水平在这两种情况下具有可比性。（B）在层粘连蛋白-221/211上培养5天的β-肌动蛋白耗竭和对照运动神经元的轴突生长锥的代表性图像在体外β-actin（洋红色）和tau（黄色）染色（比例尺：5μm）。通过GFP表达（绿色）选择细胞，表明慢病毒转导成功。与shLUC转导的对照运动神经元相比，β-actin shRNA-转导的细胞显示出明显更小的生长锥（shLUC 22.02±1.68μm2，Q216.89微米2，IQR 13.07微米2,N个= 76; shActβ14.85±1.18μm2，Q211.70微米2，IQR 11.45μm2,N个=74），β-肌动蛋白信号高度降低（shLUC 1.00±0.09，Q20.90，IQR 0.92；shActβ0.38±0.05，Q20.27，IQR 0.53）。以τ为代表的微管细胞骨架似乎没有受到影响。β-actin的再表达（“拯救”）能够拯救生长锥的大小（23.54±2.44μm2，Q217.09微米2，IQR 13.15μm2,N个=62）和β-肌动蛋白免疫反应（0.98±0.09，Q20.96，IQR 0.82）验证获得的基于β-肌动蛋白的生长锥表型。（C）钙染色层粘连蛋白221/211上β-肌动蛋白缺失生长锥的代表性图像v（v）2.2（品红色）和突触素（黄色）（标尺：5μm）。β-肌动蛋白的敲除导致钙的减少v（v）2.2信号（shLUC 1.00±0.09，Q20.84，IQR 0.75，N个= 54; shActβ0.70±0.06，Q20.52，IQR 0.46，N个=63），而突触素水平没有改变。β-肌动蛋白重测能够挽救检测到的表型（rescue 1.04±0.07，Q21.05，IQR 0.90，N个= 64).
图5
图5
生长锥细胞肌动蛋白细胞骨架缺陷trk英国−/−以及层粘连蛋白221上BDNF剥夺的胚胎运动神经元。（A）生长锥的代表性图像trk英国+/+和trk英国−/−运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天在体外并对tau（洋红色）和β-actin或F-actin（绿色）进行染色（比例尺：5μm）。TrkBTK公司−/−运动神经元发育出明显较小的生长锥(trk英国+/+34.23±2.77微米2，Q229.45微米2,n个＝20，N个= 308;trk英国电信公司−/−21.22±1.41微米2，Q222.81微米2,n个= 19,N个= 341;第页=0.0002）与β-肌动蛋白(trk英国+/+1.00±0.10，Q21.00,n个＝8，N个= 154;trk英国−/−0.55±0.12，Q20.45,n个＝8，N个= 167;第页=0.0140）和F-actin(trk英国电信公司+/+1.00±0.04，Q20.99，IQR 0.15，n个= 19,N个= 254;trk英国−/−0.76±0.11，Q2分别为0.64、IQR 0.44，n个= 18,N个= 298;第页=0.0005）与野生型对照组相比的缺陷。Tau水平在两种基因型之间具有可比性。（B）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，对β-肌动蛋白（绿色）、F-肌动蛋白和τ（蓝色）进行染色（比例尺：5μm）。CNTF和GDNF处理的运动神经元的生长锥的大小显著减小（BDNF 31.59±1.75μm2，Q231.05微米2,n个= 18,N个= 385; CNTF 23.01±2.12微米2，Q220.73微米2,n个= 17,N个= 425; GDNF 21.79±1.69μm2，Q218.27微米2,n个= 17,N个= 435; p（B-C）=0.0054，p（B-G）=0.0014）显示F-actin缺陷（BDNF 1.00±0.04，Q21.00，IQR 0.01，n个= 14,N个= 276; CNTF 0.76±0.10，Q20.79，IQR 0.33，n个= 13,N个= 308; GDNF 0.54±0.06，Q20.49，IQR 0.37，n个= 13,N个= 314; p（B-C）=0.0112，p（B-G）<0.0001）。GDNF处理的生长锥细胞显示β-肌动蛋白水平降低。Tau在每种分析条件下都具有可比性。
图6
图6
在层粘连蛋白-111上，BDNF对轴突生长和生长锥内的F-actin组装是不可或缺的。（A）的代表性图像trk英国克朗+/+和trk英国电信公司−/−运动神经元在层粘连蛋白111上培养7天在体外并对tau进行染色（比例尺：150μm）。TrkB突变运动神经元（357.2±29.33μm，Q2363微米，n个＝8，N个=579）轴突变短(第页=0.0417），与野生型对照（468.8±39.31μm，Q2454.9微米，n个= 9,N个= 615).（B）轴突生长锥的代表性图像trk英国+/+和trk英国−/−运动神经元培养5天在体外在层粘连蛋白-111上，并针对β-肌动蛋白（绿色）、F-肌动蛋白（黄色）和tau（品红色）染色（比例尺：5μm）。（C） TrkBTK公司−/−运动神经元（16.55±1.26μm2，Q217.12微米2,n个= 11,N个=178）发育出明显较小的生长锥(第页=0.0132）比相应的控制（27.51±4.58μm2，Q225.06微米2,n个= 7,N个= 113). 两种基因型之间的β-肌动蛋白、F-肌动蛋白和tau水平没有显著变化。（D）在层粘连蛋白111上培养7天的野生型运动神经元的代表性图像在体外用BDNF、CNTF或GDNF进行染色，并与τ进行对比（比例尺：150μm）。各神经营养因子（BDNF 425.3±14.93μm，Q2423.3微米，n个= 5,N个= 256; CNTF 439.0±18.37μm，Q2439.9微米，n个= 6,N个= 258; GDNF 388.6±24.47μm，Q2412.1微米，n个= 5,N个=273；p（B-C）=0.8710，p（B-G）=0.4295）。（E）层粘连蛋白-111培养5天的运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，用F-actin（洋红色）和tau（绿色）染色（比例尺：5μm）。（F）每种情况下生长锥的大小没有显著差异（BDNF 32.83±4.93μm2，Q229.04微米2,n个= 6,N个= 165; CNTF 33.01±4.41微米2，Q230.96微米2,n个= 6,N个= 175; GDNF 37.85±4.72微米2，Q238.52微米2,n个= 6,N个=172；p（B-C）=0.9996，p（B-G）=0.7352）。此外，F-actin（BDNF 1.00±0.02，Q21.00，IQR 0.04，n个= 6,N个= 165; CNTF 1.14±0.22，Q20.95，IQR 0.97，n个= 6,N个= 175; GDNF 0.99±0.28，Q20.79，IQR 1.02，n个= 6,N个= 172; p（B-C）>0.9999，p（B-G）>0.999）和tau水平似乎没有改变。
图7
图7
短暂应用BDNF于层粘连蛋白221可激活运动轴突生长锥中的trkB信号通路，导致cofilin和profilin稳定肌动蛋白的磷酸化。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外并对磷酸标记（洋红色）和突触素（绿色）进行染色（比例尺：5μm）。BDNF后，脉冲磷酸标记免疫反应性显著增加（无脉冲1.00±0.08，Q21.00,n个= 10,N个=136；5′BDNF 1.72±0.25，Q21.63,n个= 10,N个=137；第页=0.0154），而突触素水平具有可比性。（B）BDNF刺激也增加了磷酸辅酶（Ser 3，黄色）强度（pCof/cofilin–无脉冲1.00±0.03，Q21.00,n个= 11,N个= 174; 5′BDNF 1.73±0.17，Q21.69,n个= 11,N个= 176;第页=0.0003），但未改变cofilin（绿色）和synaptophysin（洋红色）（比例尺：5μm）。（C）轴突生长锥的代表性图像，用磷酸化轮廓蛋白（Tyr 129，绿色）和突触素（品红色）染色（比例尺：5μm）。在BDNF治疗后，磷酸-脯氨酸标准化为突触素的水平增强（无脉冲1.00±0.04，Q21.00 IQR 0.09，n个= 13,N个= 200; 5′BDNF 1.59±0.12，Q21.67，IQR 0.57，N个= 14,n个= 226;第页= 0.0012).（D）在BDNF脉冲生长锥中，F-actin（洋红色）显著增加（1.49±0.13，Q21.48,n个= 9,N个= 236;第页=0.0088）与非脉冲对照组（1.00±0.06，Q21.00,n个= 7,N个=194），而总β-肌动蛋白（绿色）和τ（蓝色）似乎没有变化（比例尺：5μm）。（E）培养5或6天的胚胎运动神经元轴突生长锥的活细胞成像在体外并用表达肌动蛋白-GFP的慢病毒构建物转导。BDNF脉冲前后相同生长锥的时间序列（比例尺：5μm）。施用BDNF后，丝状体动力学降低，表明肌动蛋白稳定。（F）纤丝体动力学被评估为多个kymography图，显示BDNF脉冲后肌动蛋白运动显著减少（无脉冲0.25±0.02μm/s，Q20.27μm/s，IQR 0.20μm/s，N个=49；5′BDNF 0.18±0.02μm/s，Q20.14μm/s IQR 0.16μm/s，N个= 44;第页=0.0044）。
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