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。2017年10月27日；8(1):1177.
doi:10.1038/s41467-017-01311-y。

半胱氨酸-tRNA合成酶控制半胱氨酸多硫化和线粒体生物能量学

高崎明介（Takaaki Akaike） 1, Tomoaki Ida公司 2, 范燕伟 三, 西田本弘 4 5, 鸠山由纪夫 6, Morshedul Alam先生 7, 岩原英树 8, Tomohiro Sawa先生 9, 松下铁人（Tetsuro Matsunaga） 2, Shingo Kasamatsu公司 2, 西村明彦（Akiyuki Nishimura） 4, 森田正男 2, Kazuhito Tomizawa先生 三, 西村明 2, 渡边佐治 10, 稻田贤二 10, 广岛 11, 田沼信弘 11, 郑敏君（Minkyung Jung） 2, 藤井裕本 2, 渡边康夫 12, 大村正木 13, 佩特·纳吉 14, 马丁·费利施 15, Jon M Fukuto先生 16, 本桥和美 7
附属机构

半胱氨酸-tRNA合成酶控制半胱氨酸多硫化物化和线粒体生物能量学

高崎明介（Takaaki Akaike）等。 国家公社。 。

摘要

半胱氨酸氢过硫化物（CysSSH）在各种生物体中大量存在，但对其生物合成和生理功能知之甚少。大肠杆菌和哺乳动物细胞中含有半胱氨酸的蛋白质中明显存在广泛的过硫化物形成，并被认为是由涉及硫化氢相关化学的翻译后过程引起的。在这里，我们证明了从底物L-半胱氨酸有效地合成CysSSH，这是一种由原核和哺乳动物半胱氨酸-tRNA合成酶（CARS）催化的反应。小鼠和人类细胞线粒体CARS编码基因的靶向破坏表明，CARS在内源性CysSSH生成中起着关键作用，并表明这些酶是体内主要的过硫化半胱氨酸合成酶。CARSs还催化共翻译半胱氨酸多硫化物，并参与线粒体生物发生和生物能量学的调节。因此，研究CARS依赖性过硫化物的产生可能会阐明生理和病理生理条件下异常的氧化还原信号，并提出基于氧化应激和线粒体功能障碍的治疗靶点。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
过硫化半胱氨酸（CysSSH）和CysS-（S）的形成n个–蛋白质中的H及其由EcCARS生物合成。一通过LC-MS/MS分析CysS-（S）进行定量鉴定n个–HPE-IAM标记蛋白经蛋白酶消化后在重组ADH5中形成H。b条半胱氨酸（CysSH）和CysS-（S）的形成n个–tRNA上的H（Cys-tRNACysS-（S）n个–H)通过HPE-IAM标记LC-MS/MS分析确定，该分析确定了CysSH和CysS–（S）的量n个–Cys-tRNA释放的H赛斯和Cys-tRNACysS-（S）n个–H在EcCARS酶反应中经过热处理或碱处理后合成。所采用的方法如上部面板所示。c（c）GAPDH半胱氨酸多硫化物形成并并入核糖体中从头合成的新生多肽中，如PUNCH-PsP所示（补充图10；参考补充图6）。d日CysS-（S）n个–半胱氨酸在EcCARS催化下形成H，取决于酶和底物（半胱氨酸）浓度和反应时间（下表）。EcCARS催化反应示意图（上面板）。HPE-AM，β-（4-羟基苯基）乙基乙酰胺；HPE-IAM，β-（4-羟基苯基）乙基碘乙酰胺。数据一,b条都是手段 ± 标准差(n个 = 3)
图2
图2
CysS-（S）n个–H生物合成由EcCARS及其各种突变EcCARS催化。一CysS-（S）n个–H（CysSSH和CysSS8）由EcCARS催化的半胱氨酸生物合成，作为反应时间和PLP存在与否的函数。CysS-（S）n个–通过使用HPE-IAM标记和LC-MS/MS分析对重组EcCARS（200 μg/ml），含100 μM半胱氨酸，有无50 μM磅/平方英寸。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05.b条细菌、人类和啮齿动物CARS的一般结构（上面板）和保守氨基酸序列（下面板）。c（c）,e（电子）EcCARS赖氨酸（K）突变体的酶活性c（c）和半胱氨酸（C）突变体e（电子）形成CysSSH。WT和EcCARS K和C突变体，200 μg/ml，与25反应 37μM半胱氨酸 30°C 最小数据代表平均值 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001. EcCARS-Lys的酶活性(d日)和Cys(（f）)利用ALDH1A1（55 kDa），ADH5（40 kDa），GAPDH（36 kDa）和ETHE1（28 kDa），蛋白质合成通过蛋白质印迹鉴定
图3
图3
EcCARS结构和CysS–（S）的计算建模n个–通过CARS1/2进行H生物合成。一SwissDock利用EcCARS（PDB ID:1LI5）的晶体结构生成的PLP-bounded EcCARS的分子对接模型。通过将EcCARS-Cysteinyl-tRNA二元复合物（PDB ID:1U0B）的晶体结构叠加到对接模型来放置半胱氨酸-tRNA。b条,c（c）小鼠CARS1和人CARS2合成PLP依赖的CysSSH和CysSSH。通过HPE-IAM标记LC-MS/MS分析，在重组小鼠CARS1和人CARS2（200 μg/ml），25 微米L（左）-存在或不存在100的半胱氨酸 μM PLP（37 摄氏度，2 h） 。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.01.d日PLP对重组人CARS2产生CysSSH和CysSSSH的浓度依赖性影响。人体CARS2（200 μg/ml）与25 0、10、50或100时的μM半胱氨酸 37μM PLP 30–120摄氏度 min.仅在半胱氨酸和PLP的反应混合物中，只要不大于100，就没有检测到明显的过硫化半胱氨酸生成 使用μM PLP。e（电子）PLP与人CRAS2结合的精确定量分析。用不同浓度的PLP处理人CARS2(d日)在37 1°C h与DNPH反应形成PLP-DNPH加合物，然后通过LC-ESI-MS/MS分析进行量化
图4
图4
HEK293T细胞内内源性形成过硫化物。CysSSH的细胞内水平(一)和GSSH(b条)WT和CARS2KO细胞汽车1或CARS2被撞倒了。数据是手段 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; N.S.，不显著。c（c）CARS1和CARS2用于一和b条。通道1和通道2，用每个siRNA重复测定。右侧面板显示了右侧面板中所示的西方印迹的密度分析。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001. CysSSH的生产(d日)和GSSH(e（电子）)英寸CARS2添加WT或CARS2 C和K突变体的KO细胞。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). **P（P） < 0.01; N.S.，与。CARS2KO模拟。（f）用于WT和CARS2带有WT或CARS2C和K突变体又加了回来。克细胞的蛋白质印迹d日和e（电子）不同的线粒体蛋白：MTCO1，线粒体细胞色素c（c）氧化酶亚基1（由线粒体DNA编码）和SDHA、琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A（由基因组DNA编码）。补充图16提供了完整的斑点图像。下部面板显示了western blot的密度分析。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001
图5
图5
的生成汽车2-通过CRISPR/CAS9系统的缺陷小鼠。一鼠标示意图汽车2目标位点周围WT和突变等位基因的基因结构和序列。绿色和黑色字母表示汽车2分别是。gRNA的靶向基因座和原间隔区相邻基序（PAM）序列在WT序列中分别用下划线和粗体字母表示。从汽车2-编辑过的鼠标（第1行）如下所示。b条gRNA-Cas9靶向突变检测汽车2通过PCR从WT和汽车2 +/−老鼠。汽车2 +/−,汽车2杂合KO小鼠，M：DNA分子量标记。c（c）来自肝脏线粒体的CARS2和线粒体蛋白质（例如MTCO1和SDHA）的蛋白质印迹。下部面板显示了western blot的密度分析。数据是手段 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001.d日WT和WT肝线粒体CysSSH的产生汽车2 +/−同窝老鼠。不同浓度的分离线粒体与HPE-IAM反应1 h、 然后进行LC-MS/MS分析（详见补充方法）。线粒体来自第2行汽车2 +/–小鼠（补充图20和21）*P（P） < 0.05，重量vs。汽车2 +/——小鼠（双向方差分析）。e（电子）利用WT和Cars2公司 +/–老鼠。补充图19提供了完整的斑点图像。右侧面板显示了CARS1和CARS2免疫印迹的密度分析。数据是手段 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001
图6
图6
WT和汽车2 +/−老鼠。通过HPE-IAM标记LC-MS/MS分析，在肝脏中鉴定CysSSH和其他相关多硫化物化合物的内源性生成一和肺b条从WT和汽车2 +/−室友（21周龄男性）。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01
图7
图7
体内和HEK293T细胞中的内源性蛋白质多硫化。从WT和WT小鼠肝脏中回收的全细胞蛋白中形成的CysSSH数量汽车2 +/−（第1行）21周龄男性室友(一)以及来自WT和CARS2KO HEK293T细胞(b条)通过HPE-IAM标记LC-MS/MS分析进行定量。数据是手段 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.c（c）CysSSH线粒体外释放到胞浆中的机制示意图，其可能调节全细胞蛋白多硫化
图8
图8
CARS2依赖的线粒体形态发生和生物能量学。一用MitoTracker Red荧光线粒体染色进行线粒体形态分析：HEK293T细胞（WT和CARS2让开；CARS2WT和突变体添加回来）。AU，任意单位。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). **P（P） < 0.01.b条细胞的透射电子显微镜（TEM）图像一.比例尺，1 微米。c（c）HEK293T细胞（WT和CARS2让开；CARS2WT和突变体添加回来）。进行GTP-琼脂糖下拉试验。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). **P（P） < 0.01.d日Drp1在广泛多硫化（生物素-PEG-MAL捕获法）HEK293T细胞中表达。Drp1被明显抑制并被CARS2KO和汽车1/2击倒。通道1和通道2显示了每个siRNA的重复测定。补充图23提供了完整的印迹图像。e（电子）受蛋白质多硫化和解硫化调节的Drp1活性示意图，受多硫化物与电泳物和Trx/TrxR系统的影响。（f）使用JC-1染色法对HEK293T细胞（WT和CARS2让开；CARS2WT和突变体添加回来）。数据是指 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.克HEK293T线粒体电子流的评估CARS2使用细胞外通量分析仪测量OCR，分析有或没有添加回WT和C78/257D、K124/127A和K317/320A突变体的KO细胞。鱼藤酮/抗霉素A抑制复合物I和III线粒体呼吸前后耗氧量的时间依赖性及其统计总结；数据是平均值 ± 标准差(n个 = 3). ***P（P） < 0.001
图9
图9
线粒体ETC介导CysSSH的减少。一,b条重组人CARS2体外反应的硫化物代谢产物谱分析(一)和在HEK293T细胞中表达的CARS2(b条).c（c）–小时CysSSH和HS数量的变化−（ΔHS−)由抗霉素A抑制复合物III诱导c（c）–e（电子）或通过溴化乙锭诱导的线粒体DNA（mtDNA）消除(（f）–小时)WT和CARS2KO HEK科赫293 T细胞。CysSSH和HS的值−如所示b条–小时表示细胞中以依赖于CARS2表达的方式产生的每种化合物的量，其通过减去CARS2在通过HPE-IAM标记LC-MS/MS分析对每种代谢物进行量化后，从WT细胞中的KO HEK293T细胞中提取。e（电子）,小时CysSSH和HS之间的化学计量变化（转换）−在细胞中通过ETC抑制。我ETC介导CysSSH还原形成HS的示意图−并可能进一步转换为S2O（运行）三 2−数据为平均值 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; N.S.，不显著
图10
图10
CARS介导的蛋白质多硫化物和线粒体功能。一共翻译蛋白多硫化的生理相关性，可通过各种翻译后修饰（包括去溶硫化）进行可逆调节。b条A CysS-（S）n个–与线粒体生物发生和生物能量学有关的线粒体功能的H调节机制。CysSH被还原性代谢为CysSH和HS−可被硫醌还原酶（SQR）和其他酶（如硫氧合酶（SD）和硫转移酶（ST））以与线粒体中ETC相关的方式氧化。CysS-（S）n个–依赖H的HS−代谢可能与铁硫簇的形成相耦合，由线粒体ETC I、II、III和IV控制：复合物I、II，III和IV；TCA三羧酸（Krebs）循环
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