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。2017年9月29日：11:310。
doi:10.3389/fncel.2017.00310。 2017年电子收集。

二氢青蒿素通过诱导人胶质母细胞瘤细胞线粒体和内质网凋亡及自噬细胞死亡发挥抗肿瘤活性

成滨区 1 2 三, 马骏（Jun Ma） 4 5 6, 刘小白 1 2 三, 易学学 4 5 6, Jian Zheng公司 1 2 三, 刘立波 4 5 6, 刘静（音译） 1 2 三, 甄莉 1 2 三, 张磊（Lei Zhang） 1 2 三, 刘云辉 1 2 三
附属机构

二氢青蒿素通过诱导人胶质母细胞瘤细胞线粒体和内质网凋亡及自噬细胞死亡发挥抗肿瘤活性

成滨区等。 前细胞神经科学。 。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是最高级和侵袭性的胶质瘤。双氢青蒿素（DHA）已被证明在各种癌细胞中具有抗肿瘤活性。然而，其在人类GBM细胞中的抗肿瘤活性的作用和分子机制仍有待阐明。我们的结果证明，通过CCK-8分析，DHA处理以剂量和时间依赖性的方式显著降低了细胞活力。进一步的研究表明，用Z-VAD-FMK、3-甲基腺嘌呤（3-MA）或联合预处理可挽救细胞活力。此外，DHA通过线粒体膜去极化、细胞色素c释放和caspase-9激活诱导GBM细胞凋亡。GRP78、CHOP和eIF2α的增强表达以及caspase 12的激活进一步证实，凋亡的内质网应激途径与DHA的细胞毒性有关。DHA处理的GBM细胞表现出典型的自噬形态和生化变化。氯喹（CQ）共处理显著诱导了上述效应。此外，内质网应激和线粒体功能障碍也参与了DHA诱导的自噬。进一步研究表明，活性氧（ROS）的积累归因于DHA诱导细胞凋亡和自噬。这些分子机制的说明将为人类GBM的治疗提供一个新的见解。

关键词：细胞凋亡；自噬；双氢青蒿素；内质网；胶质母细胞瘤；线粒体；活性氧物种。

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数字

图1
图1
二氢青蒿素（DHA）对人胶质母细胞瘤（GBM）细胞具有细胞毒作用。（A）DHA以剂量和时间依赖性的方式降低U87和U251细胞的细胞活力。用50、100、200和600μM DHA处理的U87和U251细胞在24小时、48小时和72小时内，细胞活力受到显著抑制。抑制率按以下公式计算：1-实验组/对照组×100%。（B）计算了24小时、48小时和72小时DHA治疗相关浓度效应反应的非线性回归曲线分析，并对24小时、48h和72小时曲线的IC50进行了F检验。（C）用Z-VAD-FMK、3-甲基腺嘌呤（3-MA）或联合用药预处理的细胞活力显著改善。Z-VAD-FMK和3-MA预处理的抑制率与对照组无差异。数据表示为平均值±标准偏差（SD；n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05，#P（P）与DHA组相比<0.05，&P（P）与DHA+Z-VAD组相比<0.05，%P（P）与DHA+3-MA组相比，<0.05。
图2
图2
DHA通过调节人GBM细胞中caspase家族蛋白诱导细胞凋亡。（A）流式细胞仪分析用于检测用DHA处理的GBM细胞的凋亡率。与对照组相比，DHA处理显著增强了凋亡细胞。早期和晚期细胞凋亡以凋亡百分比计算。（B）用DHA处理GBM细胞后活性裂解caspase-3表达水平的Western blot分析。DHA处理的GBM细胞中活性caspase-3的表达增加。（C）用DHA处理GBM细胞后活性裂解半胱天冬酶-8表达水平的Western blot分析。活性caspase-8的表达没有变化。活性裂解胱天蛋白酶-9表达水平的蛋白质印迹分析（D）和半胱天冬酶-12（E）用DHA处理后的GBM细胞。DHA处理的GBM细胞中活性裂解caspase-9和caspase-12的表达增加。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05。
图3
图3
DHA通过调节人GBM细胞的细胞色素C和UPR相关蛋白（GRP78、eIF2α和CHOP）诱导细胞凋亡。（A）流式细胞仪JC-1染色显示DHA对GBM细胞线粒体膜电位（MMP）的影响。DHA处理显著降低GBM细胞的MMP。（B）用Western blot检测DHA处理的细胞中细胞溶质和线粒体细胞色素C的表达。胞浆细胞色素C的表达增加。细胞色素C的综合光密度值（IDV）使用COX IV作为内源性控制显示。IDV计算为细胞色素C Cyto/Mito、细胞色素C细胞/COX IV和细胞色素C Mito/COXⅣ的比值。（C–E）Western blot分析检测DHA处理后GBM细胞中GRP78、CHOP和eIF2α的表达水平。在DHA处理的GBM细胞中，GRP78、CHOP和eIF2α的表达增强。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05。
图4
图4
在DHA处理的人GBM细胞中诱导完全自噬。（A）电子显微镜显示DHA处理的GBM细胞中有自噬空泡（AVs）。（B）LC3和LysoTracker Red在GBM细胞中的共定位。对LC3和LysoTracker Red的相对平均光密度以及LC3和LysoTracker-Red的共同定位进行了量化。图片分别放大(n个=4，每个）。比例尺=20μm。（C）用DHA、3-MA和氯喹（CQ）处理后，GBM细胞中LC3-II/LC3-I、LC3-II/GAPDH、p62/SQSTM1的表达水平。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05，#P（P）与DHA组相比<0.05，%P（P）<0.05或&P（P）与CQ组相比<0.05。进行蛋白质印迹分析以检测（D）LC3-II/LC3-I和LC3-II/GAPDH，（E）第62/SQSTM1页和（F）用DHA处理后GBM细胞中的Beclin-1。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05。
图5
图5
DHA诱导的自噬与内质网应激和线粒体功能障碍有关。进行蛋白质印迹分析以检测（A）GRP78，（B）CHOP和（C）用DHA、3-MA或两者联合处理后GBM细胞中的eIF2α。蛋白表达的Western blot分析（D）TOMM20和（E）用DHA、3-MA或其组合治疗后，GBM细胞中的TIMM23。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05；ᶺP（P）与DHA组相比，<0.05。
图6
图6
DHA的细胞毒性取决于人类GBM细胞中活性氧（ROS）的生成。（A）流式细胞仪分析显示，DHA处理导致GBM细胞中ROS水平升高。这个x个-轴表示荧光强度y轴表示单元格数（上部面板）。测定平均DCFH-DA荧光强度（下面板）。（B）经MnTMPyP预处理的GBM细胞显著减弱了DHA对人GBM细胞活力的抑制作用。数据表示为平均值±SD(n个每个＝5）*P（P）与对照组相比<0.05，ᶺP（P）与DHA组相比，<0.05。
图7
图7
ROS生成介导DHA诱导人GBM细胞凋亡。（A）进行蛋白质印迹分析以检测用MnTMPyP、DHA或其组合处理的GBM细胞中胞浆和线粒体细胞色素C的表达。与单独DHA处理相比，经MnTMPyP预处理的细胞显著降低了细胞溶质细胞色素C的表达。细胞色素C的IDV使用COX IV作为内源性控制。IDV计算为细胞色素C Cyto/Mito、细胞色素C细胞/COX IV和细胞色素C Mito/COXⅣ的比值。（B）Western blot分析检测经MnTMPyP、DHA或两者联合处理的GBM细胞中活性裂解caspase-9的表达。与单独DHA治疗相比，MnTMPyP组预处理后活性caspase-9的表达降低。（C–F）Western blot分析检测经MnTMPyP、DHA或两者联合处理的GBM细胞中GRP78、CHOP、eIF2α和活性裂解caspase-12的表达。与单独DHA处理相比，MnTMPyP预处理显著降低了GRP78、CHOP、eIF2α和活性裂解caspase-12的表达。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05，ᶺP（P）与DHA组相比，<0.05。
图8
图8
ROS生成介导了DHA对人GBM细胞自噬的诱导。Western blot分析检测（A）LC3-II/LC3-I和LC3-II/GAPDH，（B）第62/SQSTM1页和（C）用MnTMPyP、DHA或其组合处理的GBM细胞中的Beclin-1。与单独DHA处理相比，经MnTMPyP预处理的细胞LC3-I向LC3-II的转化以及Beclin-1的表达明显降低。与单独DHA处理相比，用MnTMPyP预处理细胞后，p62/SQSTM1的表达增强。数据表示为平均值±SD(n个=5，每个）*P（P）与对照组相比<0.05，ᶺP（P）与DHA组相比，<0.05。
图9
图9
人体GBM细胞系中DHA抗肿瘤活性的机制示意图。
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