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。2017年9月14:8:639。
doi:10.3389/fphar.2017.00639。 2017年电子收集。

内质网应激介导甲基苯丙胺诱导的血脑屏障损伤

齐晓娟 1 2, 狄文 1, 郭红燕 1, 徐冠杰 2, 刘帅 1, 钱超深 1, 刘毅（音） 1, 张文芳 三, 宾聪 1, 马春玲（Chunling Ma） 1
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内质网应激介导甲基苯丙胺诱导的血脑屏障损伤

齐晓娟等。 前沿药理学。 。

摘要

甲基苯丙胺（METH）滥用在世界范围内造成严重的健康问题，长期使用METH会破坏血脑屏障（BBB）。在此，我们探讨了内质网应激在METH诱导的BBB内皮细胞损伤中的潜在机制在体外内质网应激抑制剂对METH诱导的C57BL/6J小鼠BBB断裂的治疗潜力。永生化BMVEC（bEnd.3）细胞暴露于METH后，细胞活力显著降低，诱导凋亡，细胞单层紧密性降低。METH激活ER应激传感器蛋白，包括PERK、ATF6和IRE1，并上调促凋亡蛋白CHOP。内质网应激抑制剂显著阻断CHOP的上调。CHOP的敲除保护bEnd.3细胞免受METH诱导的细胞毒性。此外，METH提高了活性氧（ROS）的生成，并诱导了线粒体功能障碍，表现为Bcl2/Bax比值降低、线粒体膜电位崩溃和细胞色素c。ROS抑制部分逆转了内质网应激释放，CHOP的敲除部分阻断了细胞色素c的释放。最后，PBA显著减轻了C57BL/6J小鼠中METH诱导的荧光素钠（NaFluo）和Evans Blue渗漏以及紧密连接蛋白丢失。这些数据表明，BBB内皮细胞损伤是由METH诱导的内质网应激引起的，内质网胁迫进一步诱导线粒体功能障碍，PBA是METH导致BBB断裂的有效治疗方法。

关键词：细胞凋亡；血脑屏障；脑内皮细胞；内质网应激；甲基苯丙胺；线粒体功能障碍。

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数字

图1
图1
甲基苯丙胺（METH）诱导脑内皮细胞功能障碍在体外。（A）在bEnd.3细胞暴露于0.25、0.5和1 mM的METH中24小时后，使用MTT法评估细胞活力，1 mM METH显著抑制bEnd.3细胞活力。（B）bEnd后使用MTT法评估细胞活力。将3个细胞暴露于1 mM METH中24、48和72小时，METH诱导细胞活力显著的时间依赖性下降。（C）用流式细胞仪检测1 mM METH处理24、48和72 h后bEnd.3细胞的凋亡，这显著增加了细胞凋亡。（D）TUNEL阳性细胞（红色）显示凋亡细胞。在对照组（上面板，对照组）和METH（下面板，METH）处理的条件下，细胞核用DAPI（蓝色）染色，并且METH诱导细胞凋亡显著增加。（E）bEnd.3细胞经1mM METH处理24、48和72小时后，测定TEER；1 mM METH在24小时后降低TEER，48和72小时后降低逐渐增强。（F）METH治疗后24、48和72小时不同时间点紧密连接蛋白claudin5和clodin的Western blot分析。∗对< 0.05,∗∗对< 0.01,∗∗∗对与对照组相比<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图2
图2
甲基苯丙胺对内质网应激传感器和伴侣的时间依赖性效应。将bEnd.3细胞与1 mM METH孵育24 h，并使用PCR阵列检测UPR通路基因（84个基因）的表达。（A）变化显示为热点图，其中红色表示上调，绿色表示下调。（B）基因变化超过两倍或对<0.05列在表中。（C）更改显示在散点图中。（D）1 mM METH处理后不同时间点裂解产物的Western blot分析表明，p-PERK、p-IRE1α、ATF6和GRP78/Bip的增加具有时间依赖性。∗对< 0.05,∗∗对< 0.01,∗∗∗对与对照组相比<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图3
图3
甲基苯丙胺诱导前凋亡蛋白CHOP参与内质网应激。（A）1 mM METH处理后不同时间点裂解物的Western blot分析表明CHOP的增加具有时间依赖性。（B）裂解产物的Western blot分析表明，内质网应激抑制剂SB或PBA部分逆转了CHOP的升高。∗∗∗对与对照组相比<0.001。#对< 0.05,###对与METH处理的细胞相比<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图4
图4
甲基苯丙胺通过延长内质网应激和下游促凋亡途径诱导脑内皮细胞功能障碍。在用对照或CHOP siRNA转染24小时后，用或不用METH培养bEnd.3细胞24小时。（A）CHOP表达的Western blot分析。（B）MTT法检测细胞活力。（C）在用siRNA对照或siRNA CHOP转染的METH处理的bEnd.3细胞中通过流式细胞术测量的凋亡率。（D）TUNEL法测定凋亡细胞比率。（E）比较用siRNA对照或siRNA CHOP转染细胞的TEER。（F）TJ蛋白、caludin5和clodin的Western blot分析。∗∗∗P（P）与用siRNA对照或用siRNA控制和METH处理的细胞相比，<0.001。#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,###P（P）与用siRNA控制和METH处理的细胞相比，<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图5
图5
甲基苯丙胺诱导活性氧的产生和线粒体功能障碍。（A）用于ROS生成的DCFDA分析。（B）Western blot分析表明，Bcl2/Bax的降低具有时间依赖性。（C）METH诱导线粒体膜电位崩溃。（D）免疫荧光显示细胞色素c从线粒体释放到细胞质。（E）细胞色素c线粒体部分和细胞溶质部分的Western blot分析。∗对< 0.05,∗∗对< 0.01,∗∗∗对与对照组相比<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图6
图6
甲基苯丙胺介导的内质网应激诱导由活性氧激活，并通过线粒体向细胞质释放细胞色素c加速细胞损伤。（A）用活性氧抑制剂和清除剂处理后，通过Western blot分析检测内质网应激信号的标记。（B）CHOP敲除后细胞色素c释放。∗∗对< 0.01,∗∗∗对与对照组相比<0.001；#对< 0.05,##对< 0.01,###对与METH处理的细胞相比，<0.001。数据表示为重复进行的三个单独实验的平均值±SD(n个= 3).
图7
图7
内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（PBA）部分逆转了甲基苯丙胺（METH）诱导的BBB断裂体内将小鼠随机分为四个实验组：生理盐水、METH、METH+PBA和PBA。（A）克劳丁5和闭塞素的Western blot分析。（B）NaFluo的泄漏。（C）Evans Blue的泄漏：Evans蓝色在整个大脑中的外渗和量化。∗∗对< 0.01,∗∗∗对与对照组相比<0.001；##对< 0.01,###对与注射METH的小鼠相比，<0.001。数据表示为平均值±SD(n个= 3).
图8
图8
该模型说明了内质网应激和线粒体功能障碍涉及甲基苯丙胺诱导的脑内皮细胞功能障碍。METH诱导脑内皮细胞产生ROS，导致内质网应激延长。长时间内质网应激诱导促凋亡蛋白CHOP，最终导致细胞凋亡增加和细胞活力降低。同时，CHOP可进一步促进线粒体释放细胞色素c，加速内质网应激引起的细胞损伤。
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