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.2017年10月；6(10):2398-2409.
doi:10.1002/cam4.1188。 Epub 2017年9月21日。

miR-206通过靶向CDK9抑制肝癌细胞的生长

池鹏（Chi Pang） 1, 黄刚（Gang Huang） 2, 凯里·罗 1, 董玉英 1, 奉天河 2, 官魁渡 1, 曼肖（Man Xiao） 1, 王伟才 1
附属公司

miR-206通过靶向CDK9抑制肝癌细胞的生长

池鹏（Chi Pang）等。 癌症医学. 2017年10月.

摘要

miR-206在调节多癌细胞生长中起着重要作用。细胞周期素依赖性激酶9（CDK9）刺激大量生存蛋白的产生，导致癌细胞凋亡受损。然而，尚不清楚CDK9是否参与miR-206介导的肝癌细胞生长抑制。在本研究中，我们发现肝癌细胞系中miR-206的表达水平显著低于正常肝细胞系（L02）。同时，CDK9在肝癌细胞系中上调。此外，miR-206通过直接结合其mRNA 3'UTR下调肝癌细胞中的CDK9，导致RNA PolII Ser2磷酸化和Mcl-1水平降低。此外，miR-206抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡。同样，沉默或抑制CDK9也抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡。综上所述，结果表明miR-206通过靶向CDK9抑制HCC细胞的生长，提示miR-206-CDK9通路可能是治疗HCC的新靶点。

关键词：细胞凋亡；细胞周期；miR-206，肝癌，CDK9；靶向治疗。

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数字

图1
图1
肝癌细胞株表达高水平的CDK9和低水平的miR‐206。（A） qPCR分析上述细胞系中miR‐206的表达水平。Western blot和qPCR分析L02、HLE、Bell7402和HepG2细胞系中CDK9蛋白（B）和mRNA（C）的表达水平。CDK9表达的相对水平由2-∆∆CT方法，数据表示为NC控制上的折叠感应*P（P）与L02相比<0.05。
图2
图2
CDK9 mRNA的3′UTR包含miR‐206的功能靶点。（A） 强调了CDK9 mRNA 3′UTR中miR‐206的预测结合位点。（B） HepG2细胞在48孔板中培养，并与报告质粒（pmir‐CDK9、pmir‐》CDK9‐M或空pmir‐）和RNA寡核苷酸（NC或miR‐206 mimics）共转染24小时。然后用双荧光素酶报告系统测定荧光素素酶活性。萤火虫荧光素酶的活性与肾小球荧光素酶的活性相对应。转染实验至少进行3次，共三次，数据表示为NC对照组的折叠诱导*P（P） < 0.05.
图3
图3
miR‐206下调CDK9的表达。Bell7402和HepG2细胞用等量的指定质粒和/或RNA寡核苷酸转染24小时。然后以β肌动蛋白为对照，通过qPCR（A，C）检测CDK9 mRNA的水平，并以微管蛋白为负载对照，通过蛋白质印迹（B，D）检测CDK9的蛋白水平*P（P）<0.05。
图4
图4
miR‐206阻断RNA聚合酶II的激活。（A） 用所示质粒和/或RNA寡核苷酸转染Bell7402和（B）HepG2细胞48小时，然后以微管蛋白为负荷对照，通过western blot测定p-RNAII、t-RNAII和MCL-1。p-RNAII‐ser2，磷酸化RNA聚合酶II ser2；t-RNAII，总RNA聚合酶II*P（P） < 0.05.
图5
图5
miR‐206抑制肝癌细胞的增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞。（A） 用GV251‐miRNA-206转染Bell7402和HepG2细胞，并用G418筛选2-4周以建立稳定的细胞系。（B和C）。Bell7402和HepG2细胞在转染指定质粒和/或RNA寡核苷酸48小时后接种在96孔板中。然后进行CCK‐8分析以评估细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡（D–G）和细胞周期相分布（H）*P（P） < 0.05.
图6
图6
miR‐206、shCDK9和LDC000067的过度表达抑制CDK9及其下游基因的表达。用GV251‐miRNA‐206（A，E）、sh‐CDK9（C，D和F）转染Bell7402和HepG2细胞，用G418筛选2–4周以建立稳定的细胞系，或用15μmol/L LDC000067（G）处理48小时。然后以β-actin为对照，采用qPCR（A，C）检测CDK9 mRNA水平，以微管蛋白为负荷对照，采用western blot（B，D–G）检测CDK 9、p-RNAII、t-RNAII和MCL‐1蛋白水平*P（P） < 0.05.
图7
图7
shCDK9和LDC000067对CDK9的抑制抑制肝癌细胞株的细胞增殖，诱导凋亡和细胞周期阻滞。用sh-CDK9转染Bell7402和HepG2细胞，用G418筛选2-4周建立稳定的细胞系，或用15μmol/L LDC000067处理48 h，然后用CCK-8检测细胞增殖（A和B）。流式细胞术检测细胞凋亡（C-J）和细胞周期相分布（K-L）*P（P） < 0.05.
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