Physicochemical stability and transfection efficiency of cationic amphiphilic copolymer/pDNA polyplexes for spinal cord injury repair

doi:10.1038/s41598-017-10982-y

。2017年9月12日；7(1):11247.

doi:10.1038/s41598-017-10982-y。

阳离子两亲性共聚物/pDNA聚合酶修复脊髓损伤的理化稳定性和转染效率

所以Jung Gwak¹, 克里斯蒂安·麦克斯¹, Soonen Bae公司¹, 诺亚·塞西尔², Jeoung Soo Lee先生^三

附属机构

¹克莱姆森大学生物工程系，美国南卡罗来纳州克莱姆森市，29634。
²美国南卡罗来纳州克莱姆森市克莱姆森大学遗传与生物化学系，29634。
^三克莱姆森大学生物工程系，美国南卡罗来纳州克莱姆森市，29634。ljspia@clemson.edu。

PMID： 28900263
预防性维修识别码： PMC5595900
内政部： 10.1038/s41598-017-10982年

阳离子两亲性共聚物/pDNA聚合酶修复脊髓损伤的理化稳定性和转染效率

So-Jung Gwak公司等。科学代表。 2017。

。2017年9月12日；7(1):11247.

doi:10.1038/s41598-017-10982-y。

作者

So-Jung Gwak公司¹, 克里斯蒂安·麦克斯¹, Soonen Bae公司¹, 诺亚·塞西尔², Jeoung Soo Lee先生^三

附属机构

¹克莱姆森大学生物工程系，美国南卡罗来纳州克莱姆森市，29634。
²美国南卡罗来纳州克莱姆森市克莱姆森大学遗传与生物化学系，29634。
^三克莱姆森大学生物工程系，美国南卡罗来纳州克莱姆森市，29634。ljspia@clemson.edu。

PMID： 28900263
预防性维修识别码： PMC5595900
内政部： 10.1038/s41598-017-10982年

摘要

成人中枢神经系统（CNS）的多种年龄相关和损伤诱导特征对损伤后轴突再生和功能恢复构成障碍。原位基因治疗是解决中枢神经系统损伤部位促生长生物分子可用性有限的一种很有前景的方法。我们工作的最终目标是开发一种阳离子两亲性共聚物，用于同时输送药物和治疗性核酸，以促进脊髓损伤后轴突再生和可塑性。此前，我们报道了阳离子两亲性共聚物聚（丙交酯-聚乙二醇）-接枝-聚亚乙基亚胺（PgP）的合成和表征，以及其在血清中高效转染细胞pDNA的能力。我们还证明了PgP作为治疗性siRhoA载体在大鼠脊髓压迫损伤模型中的疗效。在这项工作中，我们表明，与传统支链聚乙烯亚胺对照相比，PgP/pDNA多聚酶在竞争性多阴离子和血清中核酸酶保护的存在下提供了更好的稳定性。PgP/pDNA多聚酶在冷冻干燥/重建后以及在4°C下保存长达5个月期间保持转染的生物活性，这是商业和临床应用的重要特征。我们还证明，负载有疏水荧光染料的PgP/pDNA多聚酶在局部神经组织中保留长达5天，并且PgP可以在大鼠压迫性脊髓损伤模型中有效传递pβ-Gal。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
PgP/pDNA多聚酶的肝素竞争分析（2 微克pDNA）。(一个)制备不同N/P比率的PgP/pDNA多聚酶和N/P比率为5/1的bPEI/pDNA多聚酶，并在37℃的肝素（肝素/多聚酶比率为3/1（w/w））存在下培养 30°C 最小值(B)PgP/pDNA多聚酶（2 μg pDNA），N/P比为30/1，与不同浓度（0–14肝素/pDNA（w/w）比）的肝素溶液在37 30°C 最小M：分子标记，N：裸DNA。

图2
PgP/pDNA多聚酶的稳定性（N/P比30/1，2 µg pDNA），在37℃含50%血清的培养基中培养摄氏度。分子量标记物（M，泳道1）、裸DNA（N，泳道2）、仅胎牛血清（FBS，泳道3）和PgP/pDNA多复合物在50%血清中孵育0、0.5、1、3、6、24和72小时的不同时间点（泳道4-10）。

图3
PgP/pDNA多聚酶的长期稳定性（N/P比为30/1，2 µg pDNA）摄氏度。(一个)储存于4的PgP/pDNA多聚酶凝胶阻滞试验 °C，适用于不同的时间段。分子量标记（M，第1道）、裸pDNA（N，第2道）、仅PgP（第3道）、PgP/pDNA多聚酶在储存期间的不同时间点 °C，持续0、6小时、1、3和7天，以及1、3、4、5和6个月（车道4-13）。(B)储存于4 含10%血清的培养基中B35细胞的温度为°C*第页 < 与新制备的聚合酶相比，0.05。(C)代表性图像和(D类)GFP流式细胞术直方图 + 用储存在4 摄氏度。比例尺指示200 微米。（新鲜：新鲜制备的多聚酶，W：周，M：月）。

图4
冻干后PgP/pGFP多聚酶的稳定性和转染效率。(一个)新制备的PgP/pGFP聚合酶（N/P比30/1）的稳定性，以及单独冷冻干燥或加入冷冻保护剂后的稳定性。分子量标记物（通道1）、裸质粒GFP（通道2）、新鲜多聚酶（通道3）、冻干后重组多聚酶，用0.9%NaCl冻干后重建的聚合酶（第8道）。(B)新鲜制备和冻干的PgP/pGFP多聚酶在B35细胞中的转染效果*第页 < 与新制备的聚合酶相比，0.05。^# 第页 < 0.05与无冷冻保护剂的冻干聚合酶相比。(C)代表性图像和(D类)转染PgP/pGFP多聚酶后2天GFP+B35细胞的流式细胞术直方图。新鲜：新鲜制备的多聚酶，Lyo.：冻干PgP/pGFP，Lyo。5%葡萄糖：含5%葡萄糖的冻干PgP/pGFP，Lyo。0.9%氯化钠：含0.9%氯化纳的冻干PgP/pGFP。比例尺指示200 微米。

图5
正常大鼠脊髓中N/p比为30/1的PgP/pβ-Gal多聚酶的细胞毒性。在注射后2天和7天，处死大鼠，将脊髓移植、包埋、切片，并通过TUNEL染色评估毒性。凋亡细胞用蓝色DAPI核复染染色为绿色。(一个和B)显示注射后2天脊髓中TUNEL+细胞的代表性图像（顶部：假对照，中间：N/p比为5/1的bPEI/pβ-Gal多肽，底部：N/p比为30/1的PgP/pβ-Gal多肽）。(C和D类)显示注射后7天脊髓中TUNEL+细胞的代表性图像（顶部：裸pDNA，中部：N/p比率为5/1的bPEI/pβ-Gal息肉，底部：N/p比例为30/1的PgP/pβ-Gel息肉）(一个和C)原稿放大200倍（比例尺显示100 微米）(B和D类)突出显示感兴趣区域的放大图像，原始放大倍数为400X（比例尺指示50 µm）。

图6
脊髓损伤部位局部注射DiR-PgP/pDNA多聚酶后的保留（N/P比为30/1）。(一个)DiR-PgP/pβ-半乳糖多聚酶在1,3,24的可视化用活动物荧光成像系统（IVIS）注射后3、5天。左：未注射SCI动物（对照组），右：DiR-PgP/pβ-半乳糖注射动物(B)体外注射后5天通过IVIS对DiR-PgP/pDNA多聚酶进行荧光成像。

图7
(一个)以N/p比30/1注射PgP/pβ-Gal复合物后7天，SCI模型中β-Gal表达的代表性图像（蓝色染色）。比例尺指示400 微米。(B)SCI区β-Gal+细胞（绿色）和β-III微管蛋白（红色，左）、GFAP（红色，中）和ED-1（红色，右）的双重免疫组织化学染色。合并图像显示β-Gal+细胞和β-III微管蛋白+神经元、GFAP+星形胶质细胞和ED-1+小胶质细胞/浸润巨噬细胞的共同定位。比例尺指示50 微米。

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1. Gwak，S.J.、Yun，Y.、Yoon，D.H.、Kim，K.N.和Ha，Y.3β-[N-（N′，N′-二甲胺基乙烷）氨甲酰]胆固醇修饰的PLGA纳米球作为脊髓损伤的基因传递载体的治疗应用。普洛斯一号。11 (2016).-项目管理咨询公司-公共医学
1. Yao L，等。用神经营养素-3基因功能化的多通道胶原导管介导改善横断脊髓的轴突再生。基因治疗。2013;20:149–57. doi:10.1038/gt.2013.42。-内政部-公共医学

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