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.2017年10月13日；292(41):16983-16998.
doi:10.1074/jbc。M117.792838。 Epub 2017年8月18日。

胰岛素样生长因子1信号传导对癌细胞线粒体生物发生和有丝分裂至关重要

艾米·莱昂斯 1, 迈克尔·科尔曼 1, 莎拉·里斯 1, 塞德里克·法夫尔 1, 西亚拉·奥弗拉纳根 2, 亚历山大·齐达诺夫 三, 德米特里·B·帕普科夫斯基 三, 斯蒂芬·D·赫斯汀 2, 罗斯玛丽·奥康纳 4
附属公司

胰岛素样生长因子1信号传导对癌细胞线粒体生物发生和有丝分裂至关重要

艾米·莱昂斯等。 生物化学杂志. .

摘要

线粒体活性和代谢重编程影响癌细胞的表型和靶向治疗的耐药性。我们之前确定胰岛素样生长因子1（IGF-1）诱导的线粒体UTP载体（PNC1/SLC25A33）促进细胞生长。这促使我们研究IGF信号是否对癌细胞的线粒体维持至关重要，以及这是否有助于治疗抵抗。在这里，我们表明IGF-1刺激一系列细胞系中的线粒体生物发生。在MCF-7和ZR75.1乳腺癌细胞中，IGF-1诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子1β（PGC-1β）和PGC-1α相关辅活化因子（PRC）。用siRNA抑制PGC-1β和PRC可逆转IGF-1的作用，并破坏线粒体形态和膜电位。IGF-1还诱导氧化还原调节因子核因子-红细胞生成2-样2（NFE2L2别名NRF-2）的表达。值得注意的是，获得性抗IGF-1受体（IGF-1R）酪氨酸激酶抑制剂的MCF-7细胞表现出PGC-1β、PRC和线粒体生物发生的减少。有趣的是，这些细胞表现出线粒体功能障碍，表现为活性氧物种的表达，有丝分裂介体BNIP3和BNIP3L的表达减少，以及有丝分裂受损。与此相一致，IGF-1强烈诱导了BNIP3在线粒体中的积累。其他活性受体酪氨酸激酶不能补偿线粒体保护中IGF-1R活性的降低，IGF-1R活性受到抑制的MCF-7细胞高度依赖糖酵解生存。我们的结论是，IGF-1信号传导通过BNIP3诱导刺激线粒体生物发生和周转，对维持癌细胞活力至关重要。这种核心线粒体保护信号可能会强烈影响治疗反应和癌症的表型演变。

关键词：肿瘤生物学；肿瘤治疗；细胞代谢；细胞信号；细胞表面受体；耐药性；胰岛素样生长因子（IGF）；线粒体；有丝分裂。

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数字

图1。
图1。
IGF-1诱导线粒体生物发生和线粒体基因表达。 A类用qPCR法测定在完全培养基中培养的MCF-7、MDA-MB-231和ZR75.1细胞中PGC-1α、PGC-1β和PRC的RNA表达水平，并将其归一化为看家基因UBC，与设定值为1的MDA-MB231细胞相比呈倍的变化。B类MCF-7和ZR75.1细胞的线粒体质量。将细胞缺血4 h，再用10 ng/ml或100 ng/ml IGF-1刺激20 h。用MTG探针通过FACS测量线粒体质量。C类IGF-1刺激MCF-7细胞后TOM20的免疫荧光染色。将MCF-7细胞缺血4小时，然后用100 ng/ml IGF-1刺激20小时，然后使用线粒体外膜蛋白TOM20特异性抗体制备免疫荧光(绿色). 细胞核用Hoechst染料染色(蓝色)肌动蛋白用阴茎肽染色(红色). 原始放大倍数为×40。比例尺=25μm。D类IGF-1刺激后MCF-7和ZR75.1细胞中Aralar、PNC1、TFAM和MFN1 mRNA的表达水平。细胞被血清饥饿4小时，并用10 ng/ml或100 ng/ml IGF-1刺激20小时。每个基因的表达水平被归一化为看家基因UBC，并显示为对照（血清饥饿细胞）的倍变化，设定为1。E类qPCR显示IGF-1刺激后MCF-7细胞中PGC-1β和PRC的mRNA表达水平。将细胞缺血4 h，用10 ng/ml或100 ng/ml IGF-1刺激4 h米LY294002刺激前30分钟。PGC-1β和PRC mRNA水平被归一化为看家基因UBC，并呈现为对照组（血清饥饿）的倍变化。在B类,D类、和E类，数据来自三个独立实验的平均值±S.E。使用Student’St吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).
图2。
图2。
IGF-1通过诱导PGC-1β和PRC促进线粒体生物生成。 A类在单次或同时抑制PGC-1β和PRC后，MCF-7细胞中Aralar mRNA的表达。在采集用于qPCR之前，用PGC-1α或PRC siRNA转染MCF-7。Aralar表达水平归一化为看家基因UBC，并显示为siRNA阴性对照（siNeg）设置为1的倍变化。该实验和所有qPCR实验的数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。B类同时抑制PGC-1β和PRC后，MCF-7细胞中PGC-1α和PRC mRNA的表达。在血清饥饿4h前，用PGC-1？或PRC siRNA转染MCF-7，再用10 ng/ml或100 ng/ml IGF-1刺激4h。用qPCR分析基因表达，mRNA水平被归一化为看家基因UBC，并表现为将缺血清对照组设为1的倍变化。C类同时抑制PGC-1β和PRC后，MCF-7细胞中Aralar、TFAM和PNC1 mRNA的表达B、D类，使用TMRE探针通过流式细胞术分析线粒体膜电位。用PGC-1β和PRC siRNA转染MCF-7细胞(灰色)与siNeg相比48小时(黑色). 显示了TMRE荧光的代表性直方图，散点图显示了三个独立实验的几何平均值。使用Student’s进行统计分析t吨测试表明无显著性。E类Western blot显示转染PGC-1β和PRC siRNA 48 h的MCF-7细胞中的OXPHOS和VDAC1水平。用抗OXPHOS、抗VDAC1和抗α-微管蛋白抗体对细胞进行裂解并制备Western印迹。通过与α-微管蛋白相关的密度测定进行定量，并将其归一化为siNeg对照。VDAC1的-倍变化显示在Western blot下方。F类用PGC-1β和PRC siRNA转染MCF-7细胞72小时后的免疫荧光。用线粒体外膜蛋白TOM20特异性抗体对细胞进行染色(白色).比例尺=20微米。下面放大的图像是原来的六倍大。从三个单独的实验中，在每种情况下总共100个区域（10–20个细胞/区域）中计算圆形和网状线粒体的数量，并在条形图中以总细胞数的百分比表示。G公司MCF-7细胞中PRC和PG1-βmRNA的抑制水平D–F型，通过qPCR测定。在所有面板中，数据均来自三个独立实验的平均值±S.E。使用Student’St吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.005）。
图3。
图3。
IGF-1R抑制与线粒体功能障碍相关。 A类暴露于BMS-754807 24小时后，MCF-7、ZR75.1和MDA-MB-231细胞的线粒体质量。B类暴露于LY294002 24 h后，MCF-7、ZR75.1和MDA-MB-231细胞的线粒体质量用MTG探针通过FACS测量线粒体质量。C类暴露于BMS-754807 24 h后，MCF-7细胞中PGC-1β和PRC的表达水平。通过归一化到看家基因UBC的qPCR测定PGC-1α和PRC水平，显示为未处理对照组1的倍变化。D类代表性Western blot显示IGF-1R、PI3K和MAPK信号通路的活性，分别通过IGF-1R、AKT和ERK的磷酸化水平进行测量。MCF-7和MCF-7-R细胞在添加或不添加500 n的完整培养基中培养米BMS-754807型(BMS公司)如图所示，随后用抗IGF-1R、ERK和Akt的抗磷和非磷抗体进行裂解和免疫印迹。E类磷酸化RTK阵列显示MCF-7和MCF-7-R细胞中42种不同受体酪氨酸激酶的磷酸化水平。将阵列暴露于100μg MCF-7和MCF-7-R全细胞裂解物中，并用HRP-共轭泛磷酸酪氨酸抗体进行探测。F类EGFR在MCF-7和MCF-7-R细胞中的表达。制备MCF-7和MCF-7-R细胞裂解物，并使用抗EGFR和抗β-肌动蛋白抗体通过蛋白质印迹进行分析。G公司，MCF-7和MCF-7-R细胞中的线粒体质量，使用MitoTracker Green探针通过流式细胞术测量。H（H）MCF-7和MCF-7-R细胞中的线粒体ROS，使用MitoSOX-Red探针通过流式细胞术测量。我、PGC-1β和PRC在MCF-7和MCF-7-R细胞中的表达水平。通过qPCR测定PGC-1β和PRC的水平，并将其归一化为看家基因UBC，显示为MCF-7细胞中水平的倍变化，设定为1。J型qPCR显示MCF-7与MCF-7-R细胞相比的TFAM、Aralar和PNC1水平。将每个基因的表达水平归一化为看家基因UBC，MCF-7-R细胞中的水平表示为MCF-7细胞中水平的倍变化，设置为1。K（K），qPCR显示NFE2L2在MCF-7和MCF-7-R细胞中的表达水平，所述MCF-7和MCF-7-R细胞是血清饥饿的并且是否用IGF-1刺激。NFE2L2的水平被归一化为看家基因UBC，并且与血清缺乏的MCF-7细胞相比表现为-倍的变化。数据来自三个独立实验的平均值±S.D。使用Student’St吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).
图4。
图4。
在MCF-7-R细胞中，有丝分裂介质BNIP3和BNIP3L减少。 A类、BNIP3和BNIP3L在MCF-7和MCF-7-R细胞中的表达。通过qPCR测定BNIP3和BNIP3L的水平，并将其归一化为看家基因UBC。MCF-7-R细胞中的水平表现为MCF-7细胞中水平的倍变化，设置为1。B类、BNIP3蛋白在MCF-7和MCF-7-R细胞中的表达。MCF-7细胞保存在完整的培养基中，而MCF-7-R细胞则保存在补充500 n的完整培养基中米BMS-754807。用抗BNIP3和抗β-肌动蛋白抗体溶解细胞并制备免疫印迹。C类MCF-7和MCF-7-R细胞在常氧或低氧（1%O2)条件。将细胞暴露于缺氧20小时。通过qPCR测定BNIP3水平，并将其标准化为持家基因UBC。在常氧条件下，MCF-7细胞的表达水平以倍变化的形式呈现。D类正常氧条件下MCF-7和MCF-7-R细胞中BNIP3蛋白的表达(标准)，缺氧(海普，1%O2)，或复氧(重新固定). 将细胞保持在常氧下，暴露于缺氧20 h，或暴露于缺氧20h，然后再常氧5 h。然后用抗BNIP3和抗β-肌动蛋白抗体对细胞进行裂解并制备Western印迹。E类qPCR显示，在常氧或缺氧（1%O2)条件。将细胞暴露于低氧环境下20 h。每个细胞系的BNIP3L水平（归一化为UBC表达）相对于常氧对照样品呈-倍变化。F类在50μ米氯喹(CQ公司)4或24 h。使用抗磷酸化IGF-1R、抗磷酸化AKT、抗AKT、LC3B抗体和抗α-微管蛋白抗体对细胞进行裂解并制备免疫印迹。G公司在培养基中维持500 n的MCF-7和MCF-7-R细胞中，BNIP3和BNIP3L的表达米如图所示，是否为BMS-754807。BNIP3和BNIP3L的水平归一化为看家基因UBC，其水平显示为对照水平的-倍变化(Ctrl键)MCF-7细胞。H（H）在500n浓度下，MCF-7和MCF-7-R细胞中PGC-1β和PRC的表达米如图所示，是否为BMS-754807。qPCR测定的PGC-1β和PRC水平归一化为看家基因UBC，其水平表现为MCF-7细胞水平的倍变化。所有PCR实验的数据均为三个独立实验的平均值±S.E。使用Student’st吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).我MCF-7和MCF-7-R细胞中的LC3B蛋白水平。将MCF-7和MCF-7-R细胞保存在含有或不含500 n的完整培养基中米BMS-754807，如图所示。使用抗IGF-1R、抗磷酸化IGF-1R、抗LC3B和抗β-肌动蛋白抗体对细胞进行裂解并制备免疫印迹。通过与肌动蛋白相关的密度测定法量化LCB3的表达，并将其归一化为MCF-7细胞对照。LC3B和LCB3II表达的-倍变化分别显示在Western blot的上方和下方。
图5。
图5。
BNIP3由IGF-1以PI3K依赖的方式诱导。 A类IGF-1刺激MCF-7细胞后BNIP3 mRNA表达。将细胞缺血清4 h，用10 ng/ml或100 ng/ml IGF-1刺激，并在常压或缺氧条件下再放置20 h。用100 ng/ml IGF-1激发的细胞在刺激和缺氧条件下放置之前，用LY294002或PD98059预处理。BNIP3的水平通过qPCR测定，并归一化为看家基因UBC，在血清缺乏的正常氧条件下表现为细胞水平的倍变化。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E。该图表示三个单独实验得出的平均值±S.D。使用Student的t吨测试（*，第页< 0.05; **第页< 0.01).B类IGF-1长期刺激MCF-7细胞后BNIP3蛋白表达。细胞无血清培养4小时，用10 ng/ml IGF-1刺激4–24小时。β-肌动蛋白用作负荷对照。C类，BNIP3蛋白表达依赖于PI3K活性。细胞需要血清4小时，并用10 ng/ml IGF-1刺激20小时。在IGF-1激发前30分钟添加LY294002。用抗磷酸化IGF-1R、抗磷酸化AKT、抗AKT、抗BNIP3和抗β-肌动蛋白抗体探测细胞裂解物。D类缺氧后MCF-7细胞中BNIP3的表达(海普). 将细胞保存在完整的培养基中，暴露于二甲基亚砜（−）、LY294002、PD98059或BMS-754807中，并在缺氧条件下放置20 h。使用抗BNIP3、抗磷酸-AKT、抗AKT、抗磷酸-ERK和抗ERK抗体制备细胞裂解物以进行免疫印迹。标准，氧正常。E类在常氧或缺氧条件下，BNIP3在MCF-7细胞中的亚细胞定位。对细胞进行血清饥饿处理，并用100 ng/ml IGF-1刺激20 h。然后对细胞进行裂解，并进行亚细胞分离，然后收获细胞进行裂解和用抗BNIP3和抗VDAC抗体进行蛋白质印迹。细胞表示细胞质分数，以及有丝分裂表示富含线粒体的部分。F类在Myc抑制剂存在下，IGF-1刺激后BNIP3表达。将MCF-7细胞血清饥饿4小时，并在2-MeOE2存在或不存在的情况下用100ng/ml IGF-1刺激。使用抗BNIP3、抗磷酸-AKT、抗AKT和抗β-肌动蛋白抗体制备细胞裂解物用于免疫印迹。对于所有的Western blot，至少有三个独立实验显示了类似的结果，其中一个具有代表性。
图6。
图6。
MCF-7-R细胞表现出有丝分裂水平降低，线粒体活性降低，糖酵解抑制敏感性增加。 A类，BNIP3在MCF-7和MCF-7-R细胞线粒体的定位。将细胞暴露于缺氧24小时，并用BNIP3特异性抗体制备免疫荧光(红色)和TOM20抗体(绿色)作为线粒体标记物。共刻度化，如所示白色使用“材料和方法”中描述的ImageJ Colocalization插件进行评估B类，免疫荧光显示MCF-7和MCF-7-R细胞的有丝分裂水平。细胞缺氧24小时，然后固定并染色TOM20(绿色)或指骨样蛋白（肌动蛋白，红色). 细胞核用Hoechst染色(蓝色). 该图显示了文本中描述的缺氧暴露后进行有丝分裂的细胞数量的量化。该图表示三个单独实验的平均±S.E。使用Student’st吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).C类TOM20与LAMP1在MCF-7和MCF-7-R细胞中的共定位。细胞缺氧24小时，然后固定并用抗OM20染色(绿色)或-LAMP1(红色)抗体。D类线粒体应激试验显示MCF-7和MCF-7-R细胞中的线粒体活性。这个顶部绘图显示了使用Seahorse XFp分析仪在基本条件下和添加指示的解偶联剂后2小时内测量的OCR。条形图显示了基础呼吸和ATP生成，其计算方法如“材料和方法”所述。数据表示三个独立实验得出的平均值±S.E。催化裂化装置，羰基氰化物第页-三氟甲氧基苯腙。E类MCF-7亲代和MCF-7-R细胞在暴露于25 m米二维图形。细胞最初以2.5×10的密度进行电镀4/每24小时用结晶紫染色评估细胞密度，并用奥德赛扫描定量。代表性细胞培养板如顶部面板图中显示了三个独立实验的细胞密度，即平均值±标准偏差。使用Student’St吨测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).比例尺=25微米。
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参考文献

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