Microfluidics Enabled Bottom-Up Engineering of 3D Vascularized Tumor for Drug Discovery

doi:10.1021/acsnano.7b00824

.2017年7月25日；11(7):6691-6702.

doi:10.1021/acsnano.7b00824。 Epub 2017年6月19日。

基于微流控技术的三维血管化肿瘤自下而上工程在药物研发中的应用

普拉内·阿加瓦尔, 王海（Hai Wang）, 孙明瑞, 徐江生, 赵淑婷, 刘振国, 基思·J·古奇, 易昭, 熊斌路¹, 何晓明

附属公司

PMID： 28614653
PMCID公司： PMC5663446
内政部： 10.1021/acsna编号7b00824

基于微流控技术的三维血管化肿瘤自下而上工程在药物研发中的应用

普拉内·阿加瓦尔等。美国化学会纳米. 2017.

.2017年7月25日；11(7):6691-6702.

doi:10.1021/acsnano.7b00824。 Epub 2017年6月19日。

作者

普拉内·阿加瓦尔, 王海（Hai Wang）, 孙明瑞, 徐江生, 赵树亭, 刘振国, 基思·J·古奇, 易昭, 熊斌路¹, 何晓明

附属

¹德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。

PMID： 28614653
PMCID公司： PMC5663446
内政部： 10.1021/acsna编号7b00824

摘要

开发高保真三维模型以再现肿瘤微环境对于研究肿瘤生物学和发现抗癌药物至关重要。在这里，我们报告了一种构建人类肿瘤三维微环境的方法，方法是用水凝胶壳将癌细胞封装在微囊核心，用于微型化三维培养，以首先获得无血管微肿瘤。然后，将这些微肿瘤用作构建块，与内皮细胞和其他基质细胞组装，形成三维大血管肿瘤。与2D培养的癌细胞相比，工程化3D微环境中的细胞在体内可以产生更大的肿瘤。此外，3D血管化肿瘤对盐酸阿霉素（一种常用的化疗药物）的耐药性分别是无血管微肿瘤和2D培养癌细胞的4.7倍和139.5倍。此外，这种3D血管化肿瘤的高耐药性可以通过纳米颗粒介导的药物传递来克服。高保真三维肿瘤模型对于研究微环境对肿瘤进展、侵袭和转移的影响以及制定有效的抗癌治疗策略可能有价值。

关键词：血管生成；核壳微胶囊；肿瘤微环境；血管化；血管生成。

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利益冲突声明

笔记

作者声明没有竞争性的经济利益。我们感谢Deepti Gupta在本项目期间提供的技术援助。

数字

图1
无血管3Dμ肿瘤的增殖和基因表达特征。(一)典型微胶囊的微分干涉对比度（DIC）图像显示其核壳形态，扫描电子显微镜（SEM）图像显示微胶囊核心中的胶原蛋白（1.5 mg/ml）纤维。藻类：藻酸盐和Col：胶原蛋白。(b条)微胶囊的总粒径和芯径分布以及其中细胞数量的分布。(**c（c）**)具有1.5 mg/ml胶原蛋白核心的微囊中包裹细胞的典型相位对比度和荧光（活/死）图像，显示细胞在10天内增殖。(d日)不同芯ECM的弹性模量。(**e（电子）**)定量相对细胞增殖，以微囊中不同胶原核心ECM中培养细胞获得的第10天聚集物的大小表示。将大小标准化为3 mg/ml胶原蛋白核心条件的大小。(**（f）**)定量RT-PCR数据显示基质硬度对间充质细胞表达的影响(*波形蛋白*和*CXCR4系列*)和上皮(*电子卡德林*)μ肿瘤细胞的表型标记。符号*表示对< 0.05. 比例尺：（a）DIC图像为100μm，SEM图像为5μm，（c）为100μm。

图2
在微流控灌注装置中组装μ肿瘤，形成血管化3D肿瘤。(一)不同日期血管化肿瘤的活/死染色显示高细胞活力。使用不含绿色荧光蛋白（GFP）的HUVEC。箭头和箭头分别代表微囊壳和μ肿瘤。(b条)相位对比度和荧光图像（4×）显示第4天血管形成，（1）μ肿瘤被封装在微胶囊中，（2）空微胶囊，（3）μ肿瘤没有微胶囊（在培养样品一天后，通过向样品灌注75 mM柠檬酸钠溶液5分钟，使海藻酸水凝胶壳溶解）。使用带有GFP的HUVEC。(**c（c）**)10倍的时间推移显微照片显示了4天内血管形成的进展。在出现μ肿瘤的第3天和第4天观察到广泛的血管化，而在出现空微胶囊的情况下，血管化最小。此外，在一天的培养后去除海藻酸水凝胶外壳进一步促进了血管化。箭头和箭头分别代表微囊壳和μ肿瘤。(d日)肌动蛋白丝、CD31和细胞核染色显示血管结构。横切面图像（i、ii和iii）显示血管中存在管腔。使用不含GFP的HUVEC。比例尺：（a和c）100微米，（b）200微米，（d）50微米，横截面图像：20微米。

图3
体内胶原中包裹μ肿瘤、HUVEC和hADSC的三维工程系统的致瘤性。(一)皮下注射单个2D培养的MCF-7癌细胞（条件1）、单个hADSC、HUVEC、2D培养MCF-7肿瘤细胞（条件2）、3D工程系统（条件3）的混合物后14天获得的小鼠和肿瘤照片，以及三维工程系统，在裸鼠体内注射胶原蛋白（条件4）后1天，海藻酸钠溶解。所有条件下的细胞总数都相同。(b条)皮下注射后第14天收集的肿瘤重量。(**c（c）**)肿瘤的典型组织学（H&E）图像，显示带红细胞的血管（RBC，箭头）。(d日)从四种条件下获得的肿瘤血管密度的定量测量。(**e（电子）**)肿瘤中人类CD31（hCD31，绿色）和细胞核（蓝色）免疫荧光染色的共焦图像。使用不含GFP的HUVEC。符号*表示对< 0.05. 比例尺：（a）5mm，（c）40μm，（e）100μm。

图4
三维血管化肿瘤的药物反应。(一)用游离盐酸阿霉素（DOX）孵育或治疗4天后，2D培养的癌细胞、3D无血管μ肿瘤（3D-A）和3D血管瘤（3D-V）的存活率。图中还显示了三种不同肿瘤模型的自由DOX的IC50。符号*表示对与2D培养的癌细胞相比，<0.05，#表示对与2D培养的癌细胞和3D无血管μ肿瘤相比，<0.05。(b条)由脂质（L）、富勒烯（C60）、二氧化硅（S）、DOX（D）和吲哚青绿（ICG或I）组成的LC60S-DI纳米粒子的示意图。(**c（c）**)尺寸分布和(d日)通过动态光散射（DLS）测定纳米粒子的表面zeta电位。(**e（电子）**)用不同有效DOX浓度的LC60S-DI治疗4天后，3D-V中所有细胞的存活率。(**（f）**)游离和纳米封装DOX的IC50用于破坏3D血管化肿瘤。符号$表示对当比较游离和纳米粒子包裹DOX时，<0.05。

**方案1**
自下而上方法创建三维血管化人体肿瘤的示意图。(一)使用非平面微流体封装装置将癌细胞封装在核壳微胶囊中，并将细胞在微胶囊中培养10天以形成微肿瘤（μ肿瘤，半径小于~200μm）。将注入氯化钙的矿物油、海藻酸钠水溶液（形成微胶囊外壳）、胶原水溶液（有细胞或无细胞）形成微胶囊芯，并将水提取液泵入装置通过分别为入口I1、I2、I3和I4。水相（含核壳微胶囊）和油分别从出口O1和O2流出装置。(b条)微流控灌注装置用于组装μ肿瘤和包括内皮细胞在内的基质细胞进行灌注培养，形成三维血管化肿瘤。将核壳微胶囊中的μ肿瘤与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脂肪干细胞（hADSCs）在微流体灌注装置中胶原水凝胶中组装在一起。微囊的海藻酸钠外壳被溶解，以便在静水压力驱动的灌注下，在微流体灌注装置中进行细胞间相互作用并形成3D血管化肿瘤。微柱和样品室的尺寸单位：mm；P：压力；ρ：密度；g：重力加速度；h：与水库相连的中柱高度。

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参考文献

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1. Rice J.动物模型：距离不够近。自然。2012;484页：第9页。-公共医学

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[9] Rice J.动物模型：距离不够近。自然。2012;484页：第9页。-公共医学

[10] Rice J.动物模型：距离不够近。自然。2012;484页：第9页。-公共医学

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