Multicolour localization microscopy by point-spread-function engineering

doi:10.1038/nphoton.2016.137

.2016:10:590-594.

doi:10.1038/nphoton.2016.137。 Epub 2016年8月8日。

基于点扩散函数工程的多色定位显微镜

尤夫·谢赫特曼¹, 吕西安·E·维斯¹, 亚当·S·巴克^1 2, 莫里斯·Y·李^1 三, W E莫纳¹

附属公司

¹斯坦福大学化学系，375 North-Suth Mall，Stanford，California 94305，United States。
²计算与数学工程研究所，地址：475 Via Ortega，Stanford，California 94305，United States。
^三斯坦福大学生物物理项目，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。

PMID： 28413434
PMCID公司：项目编号5391844
内政部： 10.1038/n照片2016.137

基于点扩散函数工程的多色定位显微镜

尤夫·谢赫特曼等。自然光子学. 2016.

.2016:10:590-594.

doi:10.1038/nphoton.2016.137。 Epub 2016年8月8日。

作者

尤夫·谢赫特曼¹, 吕西安·E·维斯¹, 亚当·S·巴克^1 2, 莫里斯·Y·李^1 三, W E莫纳¹

附属公司

¹斯坦福大学化学系，375 North-Suth Mall，Stanford，California 94305，United States。
²计算与数学工程研究所，地址：475 Via Ortega，Stanford，California 94305，United States。
^三斯坦福大学生物物理项目，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。

PMID： 28413434
PMCID公司：项目编号5391844
内政部： 10.1038/nphoton.2016.137

摘要

近年来，超分辨率显微镜彻底改变了细胞成像^1-4。基于单点发射器顺序定位的方法可实现约10-40 nm分辨率的空间跟踪。此外，通过各种技术，包括点扩散函数（PSF）工程，可以实现三维跟踪和成像^5-9-即以点源在图像平面中创建的形状对点源的轴向（z）位置进行编码。然而，定位显微镜仍然面临的一个挑战是高效的多色成像——这对于生物数据的上下文化至关重要。通常，多色成像需要顺序成像^{10, 11}，多个摄像头¹²，或分段的专用视野^{13, 14}在这里，我们演示了一种替代策略，即光谱信息（颜色）的编码，以及直接在图像中的3D位置。通过利用色散，我们设计了一类新的光学相位掩模，可同时为不同波长产生可控制的不同PSF，从而在单个光路中实现同时多色跟踪或超分辨率成像。

PubMed免责声明

数字

**图1。双色口罩SLM实施**
一，LC-SLM像素的相位响应是两个波长的输入电压的函数：559 nm（绿色）和699 nm（红色）。虚线表示展开的相位。b条，输入“红-绿”LC-SLM电压模式（8位灰度）。**c（c）**，两个荧光微球（红色和绿色）在LC-SLM关闭的情况下成像。d日，相同的两个微球以上的图案成像。比例尺=5µm。

**图2。双色20µm四足口罩**
一，红色的所需相位图（699 nm）。b条，绿色所需相位图（559 nm）**c（c）**，根据设计算法生成SLM电压模式。d日，通过红色波长和**e（电子）**，以绿色波长表示。**（f）**，在20µm z范围内（顶部）对40 nm红色微球的PSF进行实验测量，并从理论上计算出所需的PSF，对应于一（底部）。克，在20µm z范围内（顶部）对100 nm绿色微球的PSF进行实验测量，并从理论上计算出所需的PSF，对应于b条（底部）。比例尺为5µm。

**图3。三维多色微球同时扩散**
一，录制的扩散电影（补充视频1）中的一帧，在红色微球（用红色标记）和绿色微球（用绿色标记）扩散之后。PSF是一种多色20µm四足类，颜色之间旋转45度，如图2所示。比例尺=5µm。b条，两种微球的均方位移（MSD）曲线。**c（c）**和d日、红色微球和绿色微球的3D轨迹。轴单位为µm。色标以秒为单位编码时间。

**图4。多色超分辨率细胞成像**
一，录制的超分辨率成像电影的原始数据。绿色标签（水平拉长）和红色标签（垂直拉长）的两个示例PSF在绿色和红色插图中放大，显示延伸方向的箭头。b条，通过定位电影中的每个发射器并指定其颜色（红色=微管，绿色=线粒体）获得的超分辨率图像。插图显示了衍射极限数据。**c（c）**，中一个~2µm长微管截面周围的虚线白框内所有位置的直方图b条（深灰色，FWHM=53 nm），以及来自相同区域的衍射极限强度横截面（浅灰色，FHM=329 nm）。

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1. 黄B，王伟，贝茨M，庄X。随机光学重建显微镜三维超分辨率成像。科学。2008年；319:810–813.-项目管理委员会-公共医学

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