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.2017年5月1日；10(5):655-669.
doi:10.1242/dmm.027748。 Epub 2017年3月30日。

Grb2的细胞水平和细胞骨架稳定性在神经退行性变情况下相关

皮亚利·马朱姆德 1, 卡斯图里·罗伊 1, 布里杰什·库马尔·辛格 2, 尼哈尔·兰詹·贾纳 2, 德巴希斯·穆霍帕迪亚 3
附属机构

Grb2的细胞水平和细胞骨架稳定性在神经退行性变情况下相关

皮亚利·马朱姆德等。 Dis模型机械. .

摘要

阿尔茨海默病（AD）表现为神经元缺失。在Grb2在AD小鼠脑和AD患者脑组织中过表达的前提下，我们的研究主要集中在退行性AD样条件下细胞骨架蛋白的稳定性。AD的两个主要分子特征，即β-淀粉样低聚物的胞外积累和淀粉样前体蛋白胞内结构域水平的胞内升高，已被用于密切监测一系列信号事件。在它们存在的情况下，涉及ROCK和PAK1蛋白的多个信号通路导致细胞骨架的分解，而Grb2部分抵消了细胞骨架的丢失。Grb2-NOX4相互作用的增加对细胞骨架的分解起到预防作用，进而阻断氮氧化物的活性，并降低弹弓同源物1（SSH-1）蛋白的表达，该蛋白是细胞骨架分解的有效诱导剂。这项研究揭示了Grb2在类AD条件下保护细胞骨架结构的独特作用，并提出了控制神经退行性变的潜在新策略。

关键词：AICD；APP/PS1小鼠模型；阿尔茨海默病；细胞骨架；GRB2；生长因子受体结合蛋白2；β-淀粉样蛋白；β淀粉样蛋白前体细胞内结构域。

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数字

图1。
图1。
AD全脑裂解物和APP/PS1小鼠模型中细胞骨架蛋白表达水平降低，Grb2表达水平升高.（Aa）典型的western印迹(n个=2）四种细胞骨架蛋白-（i）α-微管蛋白，（ii）波形蛋白，（iii）α-SMA和（iv）stathmin 1，与非AD全脑裂解物相比，（v）GAPDH用作人类AD全脑溶解物的内部控制。（Ab）蛋白印迹(n个=2）显示AD全脑裂解物中的（i）Grb2和（ii）GAPDH水平。（Ac）直方图，表示根据GAPDH归一化的带的光密度平均值，表示为相对于非AD样品中的值的折叠变化。（B） 通过qRT-PCR，AD小鼠脑组织中编码α-微管蛋白、波形蛋白、stathmin 1和Grb2基因的转录水平变化，表现为相对于野生型小鼠脑组织的折叠变化，该变化与内部控制标准化Gapdh公司基因。（C） 免疫组织化学分析AD小鼠模型和WT脑石蜡包埋切片中Grb2和α-微管蛋白的表达，其中Grb2与α-微管蛋白染色均转化为灰度，细胞核用DAPI染色。放大倍数，60倍。为了获得对变化的半定量分析，使用ImageJ软件计算图像的像素密度。
图2。
图2。
在AD-mikiking神经母细胞瘤细胞模型中，Grb2上调，细胞骨架蛋白下调。（A） （i）蛋白质印迹(n个=3）显示与各自阴性对照（空白载体或试剂用溶剂）相比，AICD-转染、Aβ处理、AICD-转基因和Aβ处理细胞中Grb2和GAPDH水平的变化。（ii）与对照细胞（设为1）相比，Grb2表达的标准化变化的图形表示（分别用GFP转染、用DMSO处理以及用GFP和DMSO都转染）。（iii）qRT-PCR实验中Grb2 mRNA水平的标准化倍数变化(n个=3），表示为相对于各自阴性对照（用于试剂的空载体或溶剂）中的值的倍数变化，GAPDH被视为内部对照。（B） Western blot显示（i）α-微管蛋白、（ii）波形蛋白、（iii）α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和（iv）stathmin 1与GAPDH的表达变化。样品来源于相同的实验，并且印迹是并行处理的。（C） 直方图显示（i-iv）中四种细胞骨架蛋白的变化。显示了相对于控件的折叠更改。（D） 显示在AICD、Aβ和AICD+Aβ条件下，无论是否存在Grb2，四种细胞骨架蛋白的转录水平变化。
图3。
图3。
细胞骨架蛋白的分解分析。微管网络由α-和β-微管蛋白单体以及许多微管相关蛋白（MAP）组成。Stathmin1就是这样一个MAP。同样，肌动蛋白聚合物也由球状肌动蛋白（G-actin）单体组成。由于α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）只是肌动蛋白的一种变体，它的分解方式与普通肌动蛋白聚合物类似。波形蛋白是一组聚集的波形蛋白肽单体，具有独特的模式。（AIa）Western blot表示（i）用于疾病诱导（AICD和Aβ）和逆转（AICD、Aβ和Grb2）条件的上清液和颗粒组分中的α-微管蛋白，以及（ii）内部控制GAPDH。（iii）、（iv）总细胞裂解物中α-微管蛋白的变化。其他三种细胞骨架蛋白（波形蛋白、α-SMA和stathmin 1）的Western blot也分别在AIb（i-iv）、AIc（i-iv。（AII）显示α-微管蛋白、波形蛋白、α-SMA和stathmin 1的分解因子（S/P比）变化的条形图。数值表示为相对于阴性对照物（空载体或用于试剂的溶剂）的折叠变化。（B） 免疫细胞化学结果显示AICD转染细胞和Aβ处理细胞中α-微管蛋白聚合物轨道的分解。α-微管蛋白呈灰色，细胞核用DAPI染色标记。插入框中给出了两种情况下聚合物轨迹的缩放图像。（C） （i）微管蛋白和stathmin 1，（ii）α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和（iii）波形蛋白分解分子事件的卡通表示。
图4。
图4。
信号分子参与类AD状态。（Ai）在AD诱导（AICD+Aβ）和逆转条件（AICD+Aβ+Grb2）下，小GTP酶（即RhoA、Rac1和CDC42）活性变化的蛋白质印迹。（ii）条形图表示小型GTPase的活动变化。（B） 蛋白质水平和信号分子的激活-（i）ROCK1，（ii）ROCK2，（iii）Caspase 2，（iv）PAK1，（v）LIMK1，，（vi）cofilin，（vii）SSH-1和（viii）NOX4-通过蛋白质印迹。（ix）丝氨酸71处磷酸化波形蛋白水平的变化；这些在信号传递中起着重要作用。（C） 信号分子和磷酸化波形蛋白（pS71-vymentin）的这些变化的图示。数值显示为相对于阴性对照物（空载体或用于试剂的溶剂）的折叠变化。p-，指示蛋白的磷酸化。
图5。
图5。
Grb2和NOX4相互作用通过降低NOX4的可用性来防止细胞骨架降解。（A） 免疫共沉淀（Co-IP）印迹法，其中对Grb2进行免疫沉淀（IP），然后用抗NOX4抗体（i）和抗Grb2抗体（ii）对沉淀进行免疫印迹（IB）。反向Co-IP印迹，其中对NOX4进行免疫沉淀，然后用抗Grb2抗体（iii）和抗NOX4抗体（iv）探测沉淀。（Ba）（i）与对照组（GFP、DMSO和DsRed）相比，在AD诱导（AICD、Aβ和Ds红色）和逆转（AICD，Aβ和Grb2）条件下Grb2和NOX4相互作用的变化。（ii）（i）中所示相同斑点的NOX4条带暴露程度较高。（Bb）AD-诱导和逆转全细胞裂解物条件下NOX4和GAPDH的变化。（Bc）NOX4和Grb2之间相互作用强度的图形表示，表示为相对于对照的倍数变化（设置为1）。（Ca）（i）AD小鼠全脑裂解液中Grb2和NOX4之间的相互作用与WT对照鼠全脑裂解物相比的变化。（ii）（i）中所示相同斑点的NOX4条带暴露程度较高。（Cb）NOX4和Grb2之间相互作用强度的图形表示，显示为相对于WT大脑的折叠变化（设置为1）。与WT条件下相比，AD条件下的相互作用更强。（D） Grb2击倒下NOX4和Grb2的相互作用。Co-IP实验表明，与AICD和Aβ均大量存在的类AD情况相比，NOX4和Grb2相互作用降低。赖氨酸，全溶物。
图6。
图6。
在AD条件下细胞中发生的分子事件的表现，其中AICD和Aβ上调，Grb2过度表达Grb2。我们获得的结果用颜色表示。
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