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。2017年4月；23(4):450-460.
doi:10.1038/nm.4309。 Epub 2017年3月13日。

Gpr124对中枢神经系统疾病血脑屏障的完整性至关重要

张君磊（Junlei Chang） 1, 迈克尔·曼库索 1, 卡罗来纳州梅尔 2, 梁锡斌 三, 卡纳科·尤基 1, 陆洋 4, 杰弗里·W·广 1, 王静（音译） 三, 瓦尔沙·拉奥 5, 马里奥·瓦隆 1, 辛西娅·科辛斯基 1, 张海静（J J Haijing Zhang） 1, 阿曼达·T·马 1, 徐丽君 6, 李乐 6, 莎拉雷·戈拉明 2, 特蕾莎·F·雷耶斯 1, 芮莉（Rui Li） 7, 弗兰克·库内特 1, 韩晓源 8, 詹妮·袁 1, Shin-Heng Chiou先生 5, 阿里·布雷特曼 1, 劳伦·戴利 1, 大卫·C·科尼 1, 塞缪尔·切希尔 2, 琳达·D·肖利夫 8, 西威武（Xiwei Wu） 4, 迈克尔·斯奈德 5, 帕克强 2, 罗娜·吉法德 6, 霍华德·Y·张 7 9, 卡特琳·安德烈亚松 三, 卡尔文·J·郭 1
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Gpr124对中枢神经系统疾病血脑屏障的完整性至关重要

张君磊（Junlei Chang）等。 自然·医学。 2017年4月。

摘要

尽管血脑屏障（BBB）损害是多种中枢神经系统（CNS）疾病的主要病因，但控制BBB功能的内皮受体蛋白尚不明确。据报道，内皮G蛋白偶联受体（GPCR）Gpr124是小鼠胚胎正常前脑血管生成和BBB功能所必需的，但该受体在成年动物中的作用尚不清楚。这里，成年小鼠内皮细胞中的Gpr124条件敲除（CKO）并不影响稳态BBB完整性，但在缺血性卒中和胶质母细胞瘤小鼠模型中导致BBB破坏和微血管出血，伴有脑血管典型Wnt-β-catenin信号减少。Wnt-β-catenin信号的组成性激活完全纠正了Gpr124-CKO小鼠的BBB破坏和出血缺陷，挽救了内皮细胞基因紧密连接、周细胞覆盖和细胞外基质缺陷。因此，我们将Gpr124鉴定为成年小鼠在病理条件下内皮Wnt信号传导和血脑屏障完整性所需的内皮GPCR。这一发现暗示Gpr124是以BBB破坏为特征的人类中枢神经系统疾病的潜在治疗靶点。

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数字

图1
图1
内皮细胞Gpr124缺乏导致脑缺血和再灌注后BBB快速分解和出血性转化。(一)全球大脑的外观（顶部）和TTC染色（底部）Gpr124型-CKO和het小鼠在1h tMCAO和1-5d再灌注后；可以看到脑出血和梗死区域（TTC染色为白色）。(b条)H&E组织学分析（左）和红细胞Perl’s铁染色（右）以显示微血管出血。比例尺，100μm。(c（c）)内皮细胞（EC）的大体外观（顶部）和TTC染色（底部）Gpr124型-CKO和het小鼠在1h tMCAO和1-5d再灌注后。(d日)所示基因型的雄性小鼠在再灌注7天内出现卒中后出血的百分比。(e（电子）)EC皮层表面和梗死组织内部出血面积的量化Gpr124型-CKO小鼠和het小鼠在1h tMCAO和1-7d再灌注后。第1–2天，n个=5只小鼠；CKO 1–2天，n个=10；高度3-4天，n个= 4; CKO 3-4天，n个= 5; 高度5-7天，n个= 8; CKO 5-7天，n个= 4. n.s.，不重要*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(（f），克)男性全球生存Gpr124型-CKO小鼠(（f）)或ECGpr124型-CKO小鼠(克)再灌注1 h tMCAO和7 d后，再加上各自的het对照。P（P）<0.05，对数秩检验。(小时)通过男性肾小球TTC染色确定梗死面积的定量Gpr124型-CKO小鼠或ECGpr124型-CKO小鼠及其各自的het对照。全球的Gpr124型het小鼠，n个= 7; 全球的Gpr124型CKO、，n个= 7; 欧盟委员会Gpr124型赫特，n个= 5; 欧盟委员会Gpr124型CKO、，n个= 4. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(我)内皮细胞缺血1h和再灌注1h后血浆纤维蛋白原漏出的免疫荧光染色Gpr124型-CKO小鼠和het小鼠。箭头指向从血管中泄漏出来的血浆纤维蛋白原。比例尺，50μm。(j个)血浆纤维蛋白原泄漏的定量(我). 数据为平均值±标准误差。，n个=每组3只小鼠**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。
图2
图2
内皮细胞Wnt–β-catenin信号的激活可挽救Gpr124缺陷小鼠的出血性卒中表型。(一)的表达式Gpr124型和Wnt靶基因轴2通过RT–qPCR评估，成人大脑初级ECs中的Apcdd1Gpr124型-CKO和het小鼠；在测定mRNA水平之前，用表达小鼠IgG2αFc（Ad Fc）或Wnt7b（Ad Wnt7b）的腺病毒感染细胞2 d。数据为三次试验的平均值±标准偏差**P（P）<0.01，未配对学生t吨-测试。(b条)的表达式Gpr124型，Wnt靶基因和血脑屏障标记氯化物5，通过RT-qPCR评估，在新分离的三苯氧胺治疗的全脑EC中Gpr124型-CKO小鼠与het小鼠。平均值±标准误差。，n个=每组4只小鼠。绘制单个小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(c（c）)RT-qPCR评估Wnt-signaling靶基因在FACS分类的EC成人脑EC中的表达Gpr124型-CKO与具有或不具有组成性β-catenin激活（β-cat）的het小鼠的比较。平均值±标准误差。，n个=每组4只小鼠。绘制单个小鼠。用n个=每组4只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01与het，未成对学生的t吨-测试。(d日)折叠更改（日志2)通过RNA-seq分析评估，来自他莫昔芬治疗小鼠的FACS分类脑ECs中典型Wnt-signaling靶基因的表达，显示了与Ctnb1号机组液氧（不包括3）/+;Cdh5-CreER公司（β-cat）小鼠与Ctnb1号机组+/+;Cdh5-CreER公司（WT）小鼠(n个=每组3只小鼠），全局Gpr124型-CKO小鼠与het小鼠(n个=每组4只小鼠）。(e（电子）)通过RNA-seq分析评估的Wnt靶基因在成人脑卒中和非卒中半球的相对表达水平Gpr124型-CKO和het小鼠在1h tMCAO和1d再灌注后。对于每个基因，基因表达水平是相对于het非笔画值来表示的，并分配给0到1之间的值，以允许红-绿颜色描述。n个=每组4只小鼠**P（P）<0.01，配对学生t吨-测试。(（f）)EC脑的外观（顶部）和TTC染色（底部）Gpr124型-CKO与het小鼠比较，无论是否激活内皮组成性β-连环蛋白，在1h tMCAO和5d再灌注后均显示脑出血和梗死区域（TTC染色为白色）。(克)通过TTC染色确定梗死面积的量化。EC het，n个=5只小鼠；EC CKO、，n个= 3; EC het；β-猫，n个= 4; EC CKO；β-猫，n个= 7. **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(小时)EC的存续Gpr124型-在1h tMCAO和5d再灌注后，CKO与有或无内皮组成性β-catenin激活的het小鼠的比较*P（P）<0.05，对数秩检验。(我)通过Sulfo-NHS-生物素示踪剂渗出试验评估，显示小鼠脑缺血1h和再灌注1d后BBB完整性的代表性图像。比例尺，50μm。(j个)外渗外源性示踪剂硫NHS生物素或内源性血浆纤维蛋白原的定量。用ImageJ测量生物素或纤维蛋白原信号密度，并将其归一化为血管面积（CD31）。数据为平均值±标准误差。，n个=每组4只小鼠**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。
图3
图3
Gpr124-Wnt信号调节卒中后内皮细胞紧密连接、周细胞和细胞外基质。(一)的表达式氯化物5mRNA，通过RT-qPCR，使用FACS分类的成人大脑CD31进行评估+EC的ECGpr124型CKO与het小鼠比较，有或没有组成性β-catenin激活（β-cat）。数据为平均值±标准偏差，EC het，n个=7只小鼠；EC-CKO，n个= 8; EC het；β-猫，n个= 7; EC CKO；β-猫，n个= 6. 绘制单个小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(b条)脑缺血1h和再灌注1d后梗死脑区CD31和结蛋白的联合免疫荧光染色Gpr124型-CKO对het小鼠。箭头显示desmin+周细胞从CD31上脱落+内皮细胞。比例尺，20μm。(c（c），d日)梗死脑区Pdgfr-β和CD31的联合免疫荧光染色(c（c）)周细胞覆盖率的量化(d日)内皮细胞缺血1h和再灌注5d后Gpr124型CKO与具有或不具有组成性β-连环蛋白激活的het小鼠的比较。Pdgfr-β或结蛋白染色信号表面的长度归一化为CD31的长度；每只小鼠6-8个低功率场，EC het，n个= 4; EC CKO、，n个= 3; EC het；β-猫，n个= 4; EC CKO；β-猫，n个= 4. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。比例尺输入c（c），100微米。(e（电子）)Pdgfb公司表达，由评估就地杂交，在EC的梗死大脑皮层Gpr124型-CKO小鼠和het对照在1小时tMCAO和1天再灌注后。三只老鼠的代表性图片。(（f）)的表达式Pdgfb公司经RT–qPCR评估，来自EC的成人脑ECGpr124型1小时tMCAO和1天再灌注后CKO与het小鼠的比较。将两只小鼠的梗死脑组织合并成一个样本；EC het、，n个=6，EC CKO，n个= 7. 绘制单个小鼠*P（P）<0.05与EC het，未成对学生t吨-测试。(克)的表达式Pdgfb公司经RT–qPCR评估，EC小鼠成年脑ECGpr124型-具有或不具有组成性β-catenin激活（ECβ-cat）的het小鼠。数据为平均值±标准误差。；n个=每组4只小鼠*P（P）<0.05，未成对学生t吨-测试。(小时，我)梗死脑区层粘连蛋白和CD31以及IV型胶原（col IV）和CD31的联合免疫荧光染色(小时)ECM蛋白水平的量化(我)1h tMCAO和再灌注5d后。层粘连蛋白和col IV信号密度归一化为CD31信号区。每只小鼠随机选择6-8个低功率场。数据为平均值±标准误差。，n个=每组4只小鼠**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。比例尺输入小时，100微米。(j个)EC梗死脑皮质CD31染色Gpr124型-在1h tMCAO和5d再灌注后，CKO与有或无组成性β-catenin激活的het小鼠的比较。比例尺，100μm。(k个)通过CD31信号区与脑组织面积的百分比评估微血管密度(j个). 每只老鼠随机选择五到六个低功率场。数据为平均值±标准误差。，n个=每组4只小鼠。绘制单个小鼠。
图4
图4
实验性胶质母细胞瘤中内皮细胞Gpr124缺乏增加肿瘤出血并降低生存率。(一，b条)小鼠正常脑组织中Gpr124和CD31的联合免疫荧光染色(一)和GL261胶质母细胞瘤(b条). 这些图像代表了从五只老鼠身上获得的图像。比例尺，100μm。(c（c）)全球的生存Gpr124型-CKO和het用植入的GL261胶质母细胞瘤细胞控制小鼠。n个=每组15只小鼠。P（P）<0.02，对数秩检验。(d日)全球脑肿瘤的大体外观和H&E组织学Gpr124型-CKO和het对照小鼠。显示了15-20个肿瘤的代表性图像。比例尺，100μm。(e（电子）)的表达式Gpr124型根据RT–qPCR评估，在FACS分类的CD31中+EC正常脑和肿瘤组织中的ECGpr124型-CKO和het小鼠。n个=6个EC het-normal、EC CKO-normal和EC CKO-tumor样本，以及n个=5个EC het-肿瘤样本；每个样品由FACS分类的CD31组成+来自相同基因型的两个小鼠的混合正常或肿瘤组织的内皮细胞。数据为平均值±标准误差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01与EC het-normal，未配对学生t吨-测试。(（f）)EC脑肿瘤的外观及H&E分析Gpr124型-CKO小鼠与het对照。显示了15-20个肿瘤的代表性图像。比例尺，100μm。(克)瘤内水肿，量化为肿瘤内没有肿瘤细胞但充满血细胞或血浆的间隙面积，相对于肿瘤总面积。全球的Gpr124型赫特，n个= 4; 全球的Gpr124型CKO、，n个= 4; 欧盟委员会Gpr124型赫特，n个= 6; 欧盟委员会Gpr124型CKO、，n个= 6. **P（P）<0.01，未配对学生t吨-测试。(小时，我)量化肿瘤体积，无需(小时)和(我)水肿补偿。全球的Gpr124型赫特，n个= 4; 全球的Gpr124型CKO、，n个= 4; 欧盟委员会Gpr124型赫特，n个= 6; 欧盟委员会Gpr124型CKO、，n个= 6. 数据为平均值±标准偏差。绘制单个小鼠。n.s.，不重要*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。
图5
图5
内皮细胞激活Wnt–β-catenin信号减少内皮特异性肿瘤出血和水肿Gpr124型-删除胶质母细胞瘤小鼠。(一)Wnt-signaling靶基因的表达轴2和Apcdd1号机组根据RT–qPCR评估，在FACS分类的CD31中+EC正常脑和肿瘤组织中的ECGpr124型-CKO和het小鼠。n个=6个EC het-normal、EC CKO-normal和EC CKO-tumor样本n个=5个EC het肿瘤样本；每个样品都是FACS分类的CD31+来自相同基因型的两个小鼠的混合正常或肿瘤组织的内皮细胞。数据为平均值±s.e.m*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(b条)EC脑肿瘤小鼠IgG（mIgG）和CD31的大体外观、H&E组织学和联合免疫荧光染色Gpr124型-CKO与具有或不具有组成性β-连环蛋白激活的het小鼠的比较。EC het、，n个= 8; EC CKO、，n个= 6; EC het；β-猫，n个= 6; EC CKO；β-猫，n个= 6. 显示了具有代表性的图像。比例尺，100μm。(c（c）)小鼠IgG信号密度相对于CD31信号密度的定量b条。每只老鼠随机选择五到六个低功率场。a.u，任意单位。n个=每组4只小鼠。数据为平均值±标准误差**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(d日)瘤内水肿，量化为肿瘤内没有肿瘤细胞但充满血细胞或血浆的间隙面积，相对于肿瘤总面积。EC het、，n个= 5; EC CKO、，n个= 5; EC het；β-猫，n个= 5; EC CKO；β-猫，n个= 6. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(e（电子），（f）)EC中肿瘤体积的量化Gpr124型CKO与具有或不具有组成型β-连环蛋白激活的het小鼠(e（电子）)或有补偿(（f）)用于水肿。EC het，n个= 5; EC CKO、，n个=5；EC het；β-猫，n个= 5; EC CKO；β-猫，n个= 6. (克)肿瘤血管密度，量化为相对于肿瘤组织面积的CD31-阳性信号区，并校正水肿。每只小鼠随机选择6-8个低功率场。EC het、，n个= 6; EC CKO、，n个= 5; EC het；β-猫，n个= 5; EC CKO；β-猫，n个= 4. *P（P）<0.05，未成对学生t吨-测试。数据为平均值±标准误差。
图6
图6
Gpr124-Wnt信号通过调节紧密连接蛋白、周细胞覆盖率、谷氨酸1和ECM增加胶质母细胞瘤中BBB的完整性。(一)GL261移植EC肿瘤中Cldn5和CD31的联合免疫荧光染色Gpr124型CKO与具有或不具有组成性β-连环蛋白激活的het小鼠的比较。比例尺，100μm。(b条)中Cldn5信号密度的量化(一)归一化为CD31信号区。每个肿瘤随机选择6-8个低功率场。n个=每组4只小鼠。数据为平均值±标准误差**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(c（c），d日)肿瘤Pdgfr-β和CD31的联合免疫荧光染色(c（c）)周细胞覆盖率（Pdgfr-β+和结蛋白+，d日)在内皮细胞中Gpr124型CKO与具有或不具有组成性β-连环蛋白激活的het小鼠的比较。将Pdgfr-β和结蛋白信号区标准化为CD31信号区。每只小鼠随机选择6-8个低功率场。n个=每组4只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(e（电子）)的表达式Pdgfb公司通过RT–qPCR评估，在FACS分类的EC脑肿瘤EC中Gpr124型-CKO和het小鼠。n个=EC het的5个样品，n个=6个EC CKO样品；将两只小鼠的肿瘤组织合并为一个样本。数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05，未成对学生t吨-测试。(（f），克)肿瘤区域层粘连蛋白和CD31以及IV型胶原（col IV）和CD31的联合免疫荧光染色(（f）)ECM蛋白质丰度的量化(克). 层粘连蛋白和col-IV信号密度归一化为CD31信号区。每只小鼠随机选择6-8个低功率场。n个=每组4只小鼠*P（P）<0.05，未成对学生t吨-测试。(小时)EC肿瘤中谷氨酸1和CD31的联合免疫荧光染色Gpr124型-CKO与具有或不具有组成性β-连环蛋白激活的het小鼠的比较。请注意，这两种肿瘤细胞中谷氨酸1的强表达Gpr124型het和CKO肿瘤。比例尺，100μm。(我)谷氨酸1数量的量化+肿瘤血管。每个肿瘤计数100–200条血管。n个=每组4只小鼠。数据为平均值±标准误差**P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。(j个)图示Gpr124缺乏引起的病理性血脑屏障破坏和出血的潜在机制的示意图。在缺血性卒中或胶质母细胞瘤中，内皮细胞Gpr124缺陷降低Wnt7依赖的典型β-catenin信号传导，导致β-catentin激活-可逆效应：紧密连接蛋白（Cldn5）丢失和Pdgfb公司表达、周细胞损失、ECM破坏（层粘连蛋白、IV型胶原）和内皮Glut1表达下调（仅在胶质母细胞瘤中）。Gpr124缺失仅在GL261 GBM中损害血管生成，但在急性卒中情况下不损害血管生成。
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