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.2017年2月13日：7:42092。
doi:10.1038/srep42092。

血管平滑肌细胞糖萼通过Rho激酶（ROCK）-肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）途径介导剪切应力诱导的收缩反应

红岩康 1, 刘佳佳 1, 孙安强 1, 小刘 1, 范玉波 1, 邓晓燕 1
附属公司

血管平滑肌细胞糖萼通过Rho激酶（ROCK）-肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）途径介导剪切应力诱导的收缩反应

红岩康等。 科学代表. .

摘要

血管平滑肌细胞（VSMC）暴露于间质流诱导的剪切应力，这种剪切应力可能由表面糖萼（主要由蛋白聚糖和糖蛋白组成的表层）感应，以调节肌源性反应期间的细胞收缩。因此，我们试图阐明剪切应力调节的SMC收缩中糖萼机械传递的信号途径。剥夺血清3-4天的人脐静脉平滑肌细胞（HUVSMCs）暴露于递增（0至20 dyn/cm2)在平行板流动室中的剪切应力下，细胞面积的减少被量化为收缩。评估Rho激酶（ROCK）及其下游信号分子、肌球蛋白磷酸酶（MYPT）的肌球蛋白结合亚基和肌球蛋白轻链2（MLC2）的表达。结果表明，HUVSMC在剪切应力作用下30min可显著诱导细胞收缩，伴随着ROCK1上调、再分布以及MYPT1和MLC活化。然而，肝素酶III或Y-27632预处理可以完全消除这些剪切诱导现象。这些结果表明，剪切应力诱导的VSMC收缩是由细胞表面糖萼通过ROCK-MLC磷酸酶（MLCP）途径介导的，为肌源性反应中糖萼的机械传递提供了证据。

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作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1。在对照平滑肌细胞培养基或无血清DMEM中培养2天和4天后，流畅HUVSMC的代表性视频图像。
这些图像是在×4放大倍数下拍摄的。采用实时PCR检测平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的mRNA水平，并用2-ΔΔCt对照细胞和缺血清细胞的方法。
图2
图2
(A类)在对照平滑肌细胞培养基或无血清DMEM中培养2天和4天的后融合HUVSMC上的平滑蛋白（左）和MYH11（右）的代表性免疫荧光图像。绿色：光滑（左）/MYH11（右）。蓝色：DAPI。比例尺：50 微米。(B)平滑蛋白（左）和MYH11（右）的归一化荧光强度。将数据归一化为对照组-2 d*P（P） < 0.05与对照组。
图3
图3。HUVSMC表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖的免疫荧光图像。
(A类)对照组表示未经酶处理。(B) 0.2 U/ml肝素。III治疗1次 小时。(C类) 10 μM Y-27632处理1次 小时。(D类)阴性对照。(E类)对照和阴性对照的最大强度Z投影图像的“计数值”曲线。曲线之间的非零交点被定义为背景阈值。HS的覆盖范围定义为数值等于或高于阈值的区域除以总面积，并以百分比表示。F： GCX的控制范围，Hep。III或Y-27632处理的细胞。比例尺：50 微米。(C类)控制。NC：阴性对照。GCX：糖萼*P（P） < 0.05与对照组。
图4
图4
之前HUVSMC的代表性视频图像(A类,C类,E类,G公司)静置30分钟后(B)或20 达因/厘米2剪切应力(D类,F类,G公司)暴露。(A类和B)静态条件下未经酶处理的HUVSMC。(C类和D类)未经酶处理的HUVSMC暴露于剪切应力条件下。(E类和F类)用0.2预处理HUVSMC U/ml肝素。III代表1 暴露于剪切应力条件下的小时数。(G公司和H（H）)用10预处理HUVSMC μM Y-27632用于1 暴露于剪切应力条件下的小时。这些图像是在  x 4倍放大。
图5
图5。HUVSMC的细胞面积分布（有或无静电处理或30分钟暴露）20 达因/厘米2剪切应力条件。
(A类)未经处理的对照细胞暴露于剪切。(B)未经静电处理的对照细胞。(C类)用0.2预处理HUVSMC U/ml肝素。III代表1 暴露于剪切的小时数。(D类)用10预处理HUVSMC μM Y-27632用于1 暴露于剪切的小时数*P（P） < 0.05 vs.时间0**P（P） < 0.01 vs.时间0。
图6
图6
(A类)30后的标准化细胞面积 最小静态值或20 达因/厘米2有无Hep的剪切应力暴露。III或Y-27632治疗。细胞面积归一化为时间0的平均值。(B)30后HUVSMC的纵横比 最小静态值或20 达因/厘米2有无Hep的剪切应力暴露。III或Y-27632治疗。对5–9张图像中的100–300个细胞进行分析。使用4个独立实验的数据计算最终平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05与剪力**P（P） < 0.01与0 最小值（剪力）。
图7
图7。HUVSMC与DAPI（细胞核，蓝色）和ROCK1抗体（绿色）共同染色。
将细胞分为以下6组：对照组（未经处理且无剪切）、剪切组（未处理但30分钟20 达因/厘米2剪切应力暴露），Hep。三（0.2 U/ml肝素。III治疗，无剪切），Hep。三 + sh（0.2 U/ml肝素。III处理，然后暴露于剪切），Y-27632（10 μM Y-27632处理且无剪切）和Y-27633 + 第（10）页 μM Y-27632处理后暴露于剪切）。比例尺：50 微米。箭头表示分布在单元格边界上的ROCK1。
图8
图8。对照和Hep的归一化ROCK1荧光强度。III或Y-27632处理的HUVSMC对无流量或30分钟的反应20 达因/厘米2剪切应力。
ROCK1的平均荧光强度归一化为对照组。对第4代至第6代HUVSMC进行三个独立实验，以获得最终平均值 ± 扫描电镜**P < 0.01与对照组。缺点：对照细胞未经处理，无剪切。Sh：未经处理但暴露30分钟的对照细胞20 达因/厘米2剪切应力。肝素：0.2 U/ml肝素。III处理，无剪切。Hep公司 + 第0.2页 U/ml肝素。III处理，然后暴露于剪切。Y： 10个 μM Y-27632处理，无剪切。Y（Y） + 数字：10 μM Y-27632处理后暴露于剪切。
图9
图9。含或不含Hep的HUVSMC的MYPT1、p-MYPT1、MLC和p-MLC的Western blots分析。III或Y-27632治疗以应对无流量或30分钟20 达因/厘米2剪切应力。
GAPDH作为内参照基因。密度计通过GAPDH进行标准化，然后通过对照进行标准化*P（P） < 0.01与对照组。对于MYPT1、MLC、p-MLC、n = 7; 对于p-MYPT1，n = 4
图10
图10
(A类)30分钟前后的HUVSMC 20 达因/厘米2剪切应力暴露与DAPI（细胞核，蓝色）和p-MLC（红色）共同染色。比例尺：50 微米。(B)相对于控制无流量条件的标准化p-MLC荧光强度*P（P） < 0.01 vs.控制无流量（0 最小值）。
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