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.2017年1月12日；541(7636):176-181.
doi:10.1038/nature20793。 Epub 2016年12月21日。

Piezo2感知气道拉伸并介导肺膨胀引起的呼吸暂停

野村惠子 1, Seung-Hyun Woo先生 1, Rui B Chang先生 2, 阿斯特里德·吉利奇 三, 邱兆珠 1 4, 阿兰·弗朗西斯科 1, 桑吉夫S牧场 1, 斯蒂芬·D·利伯莱斯 2, 阿尔登·帕塔普提安 1
附属公司

Piezo2感测气道扩张并调节肺膨胀引起的呼吸暂停

野村惠子等。 自然. .

摘要

呼吸功能障碍是婴儿围产期死亡和成人睡眠呼吸暂停的恶名昭彰的原因，但呼吸控制的机制尚不清楚。气道传递的机械信号对感觉神经元控制呼吸；然而，这些信号的生理意义和分子机制仍不清楚。在这里，我们表明机械激活离子通道Piezo2的全局和感觉神经元特异性消融会导致新生小鼠呼吸窘迫和死亡。压电陶瓷的光生激活+迷走神经感觉神经元导致成年小鼠窒息。此外，在正常情况下，诱导消融成年小鼠感觉神经元中的压电陶瓷会导致神经元对肺膨胀的反应减弱，Hering-Breuer机械弹性受损，潮气量增加。这些表型在结状神经节缺乏Piezo2的小鼠中复制。我们的数据表明，Piezo2是一种气道拉伸传感器，在各种气道神经感觉神经元中，Piezo2介导的机械传导对于建立出生时有效的呼吸和维持成人的正常呼吸至关重要。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。肺发育特征压力计2−/−老鼠
a、 b条，E16.5肺左叶αSMA的整体染色(一)和E18.5(b条)野生型和压电陶瓷2−/−老鼠。L1–L6，左叶外侧支。E16.5：野生型n个= 4,压电陶瓷2−/− n个= 3; E18.5：野生型n个= 4,压电陶瓷2−/− n个= 5. 观察到正常的气道和血管传导模式压电陶瓷2−/−胚胎晚期的肺。c、 d日，E-cadherin和Muc-1的全套免疫染色(c（c）)或E-cadherin、T1α和SpC(d日)E18.5野生型和压电陶瓷2−/−老鼠。箭头表示近端（P）到远端（D）方向。左侧面板，放大倍数较低；右侧面板，远端区域放大倍率较高。右侧面板中的实心圆圈表示远端区域的肺泡祖细胞。左侧面板中的实心六边形表示新生的I型肺细胞。左侧面板中的黄色虚线圆圈表示新生的II型肺细胞。观察到上皮形态正常，肺泡上皮模式和分化无缺陷压电陶瓷2−/−肺。e（电子）、野生型和压电陶瓷2−/−新生肺。黑色箭头表示I型肺细胞延伸。白色虚线圆圈标记II型肺细胞。白色圆圈内的白色箭头表示层状体。红细胞，红细胞。对每个基因型四只小鼠的样本进行分析。观察到I型和II型肺细胞、内皮细胞、红细胞和表面活性蛋白的正常形态和类似丰度压力计2−/−与野生型肺相比。（f），在E18.5分娩后6小时的湿干肺比率，以评估胎儿肺液的清除情况。NS，统计上不显著。未付费学生的t吨-测试。条形图表示平均值±标准差。克出生后第0天肺、心脏和肝脏重量的百分比（P）归一化为全身重量。条形图表示NS的平均值±s.e.m.，在统计学上不显著。Kruskal–Wallis非参数检验（肺和肝）或单向方差分析（心脏）。标尺，500µm(a、 b条); 33微米(c、 d日，左）；22微米(c、 d日，右）；5微米(e（电子）).
扩展数据图2
扩展数据图2。呼吸系统中的Piezo2表达
一P0中GFP和Nefh的联合免疫抑制压电陶瓷2GFP公司记者龙。NEB箭头。右侧较小的面板显示了GFP和CGRP（NEB标记）染色NEB的放大视图。b、 c（c）颈静脉结节复合物中GFP免疫染色(b条)和成人(c（c）)压电陶瓷2GFP公司报告鼠。虚线划定了颈静脉-结节复合体的边界。d、 e（电子）P0三叉神经节GFP免疫染色(d日)或成人胸部DRG(e（电子）)来自压电陶瓷2GFP公司报告鼠。中的虚线(d日)划定三叉神经节的边界。（f），P0矢状切面中GFP和NeuN的联合免疫染色压电陶瓷2GFP公司脑干。g、 小时P0，GFP和αBTX（神经肌肉接头标志物）联合染色压电陶瓷2GFP公司隔膜(克)和肋间肌(小时).我、GFP和NeuN在成人中的协同免疫压电陶瓷2GFP公司腰椎脊髓。圆点表示运动神经元定位。j个、GFP和NeuN在成人中的协同免疫压电陶瓷2GFP公司脑干。圆点标记迷走神经X背核。k个成人胸交感神经节GFP和Tuj1的共免疫压电陶瓷2GFP公司报告鼠。我，呼吸系统中Piezo2–GFP表达的示意性总结。七、 面神经核；BötC，Bötsinger杂岩；VRG，腹侧呼吸组；RB，肋骨；Vt，心室。标尺，20µm（中右侧较小的面板一)，100µm（所有其他面板）。
扩展数据图3
扩展数据图3。td番茄在小鼠呼吸系统中的表达特征压电2-GFP-IRES-Cre(压电陶瓷2GFP公司)；Ai9公司报告小鼠
a、 b条，PECAM1免疫染色(一)和CGRP(b条)出生后肺部出现td番茄荧光。箭头在(b条)表示td番茄+神经纤维支配NEB(b条)划定肺上皮。c（c），td番茄在P0颈静脉-结节复合物中的表观荧光。中的虚线(c（c）)划定颈静脉-结节复合体的边界。d日，td成人胸部DRG的番茄表观荧光。e、 （f），td番茄成虫孤束核（NTS）的表观荧光(e（电子）)成人三叉神经脊核（Sp5）(（f）)其中，结节和颈静脉/三叉神经感觉神经元的轴突分别投射,。中右侧的较小面板（f）用Nefh染色显示Sp5的放大视图。g–i类P0脑干组织中td番茄表荧光PECAM1免疫染色(克)，成人隔膜(小时)和P0肋间肌(我).j个出生后腰椎脊髓的td番茄表观荧光PV免疫染色。圆点表示运动神经元定位。k个，成人胸交感神经节中用tdTomato表观荧光进行Tuj1免疫染色。我成年报告小鼠气管副交感神经节ChAT免疫染色和td番茄表观荧光。标尺，25µm(a、 我，中右侧的较小面板（f）)，20微米(b条)，100微米(c–k码).
扩展数据图4
扩展数据图4。组织特异性Cre活性的表征爱9记者
a、 b条，td番茄P0表观荧光Tie2Core；Ai9公司肺PECAM1染色(一)或CGRP染色(b条).c（c），td番茄P0表观荧光Tie2Core；Ai9公司颈静脉-结节复合物，PECAM1染色。虚线划定了颈静脉-结节复合体的边界。d日，td成人番茄表观荧光Tie2Core；Ai9公司胸部DRG。虚线划定DRG的边界。e（电子），td番茄P0表观荧光Tie2Core；Ai9公司腺苷染色三叉神经节。TdTomato信号与PECAM1共同定位+内皮细胞一和c（c）.f–i型，td番茄P0表观荧光Phox2bCre；Ai9公司CGRP染色肺(（f）)Advillin染色显示P0颈静脉-结节复合物(克)，成人胸部DRG(小时)腺嘌呤染色显示三叉神经节P0(我). 结节性神经节存在TdTomato信号(克)但在肺细胞和NEB中不存在(（f）)，颈静脉神经节(克)，DRG（图纸）(小时)和三叉神经节(我). 箭头在（f）表示td番茄+支配肺上皮的迷走神经纤维。中的虚线小时划定了DRG的边界。j–m，td番茄P0表观荧光Wnt1芯；Ai9公司CGRP染色肺(j个)，P0颈静脉-结节复合体(k个)，成人胸部DRG(我)和成年颈静脉结节复合体，用压电染色(米).米，米〃，高倍图像米箭头显示tdTomato在颈静脉神经元细胞体和卫星细胞中表达。箭头仅在卫星细胞中显示tdTomato表达。颈静脉神经节神经元胞体中存在TdTomato信号(k、 米)和DRG(我)颈静脉结节复合体和DRG中的卫星细胞(k–m（千米）)但在肺细胞和NEB中不存在(j个)结节神经节的神经元胞体(k、 米). Td番茄+神经纤维支配肺部(j个). 虚线表示神经节的边界。VII+VIII，面部声学复合体。标尺，50µm(b条)，12.5微米(米，米〃)，100µm（所有其他面板）。
扩展数据图5
扩展数据图5。Piezo2条件敲除小鼠中Piezo2敲除的特征
一，表征压电陶瓷2使用FACS分选的CD31通过qRT-PCR敲除+（或PECAM1+)成人野生型和Tie2Core；压电陶瓷2cKO公司老鼠。b条,压电2原位成年野生型和Phox2bCre；压电陶瓷2cKO公司老鼠。圆点标记结节神经节（N）。c（c），qRT-PCR，使用从P0野生型和Wnt1芯；压电陶瓷2cKO公司幼崽*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，未配对韦尔奇t吨-测试a、 c（c）。数据表示为平均值±标准立方米比例尺，100µm。
扩展数据图6
扩展数据图6。压电陶瓷的光生激活+迷走神经感觉神经元压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2老鼠
一，迷走神经短暂光遗传刺激（蓝色闪电信号）后的复合动作电位反应压力计2GFP公司;液氧-ChR2老鼠。b条根据复合动作电位中相应的峰面积对A、C电流进行分类。虚线：A–C比率为1。数据以平均值±标准误差表示。c（c），GFP，Nefh和IB4在成人中的共染色压电陶瓷2GFP公司颈静脉-结节复合体。红色箭头表示GPF+Nefh公司+IB4类−细胞；蓝色箭头表示GFP+Nefh公司−IB4型+细胞。d日、成人GFP+细胞中Nefh或IB4阳性细胞的百分比压电陶瓷2GFP公司颈静脉-结节复合体。e–g，迷走神经光遗传刺激（50 Hz，10 s）后的呼吸滞留状态压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2老鼠。代表性的痕迹显示了视基因激活后肺容积的变化压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2老鼠(e（电子）). 总肺容量变化百分比压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2无光和有光的老鼠(（f）). 高肺容量状态下的时间百分比（大于潮气呼吸期间的平均肺容量）压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2无光和有光的老鼠(克). ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，成对t吨-试验，平均值±标准误差。小时，头脑风暴压电陶瓷2GFP公司带有AAV-flex-td番茄颈静脉-结节复合体注射。溶胶，孤束；CC，中央运河；AP，最后面积；L-NTS；腹侧、外侧、腹外侧、间质和中间NTS亚核；M-NTS；背外侧、背内侧、内侧和连合NTS亚核。比例尺，100µm。
扩展数据图7
扩展数据图7。AdvillinCreER的特性T2段和PvalbCre活动通过Ai9公司记者
一成人肺组织中的td番茄表观荧光和DAPI染色AdvillinCreER公司T2段;Ai9公司 +Tam公司报告鼠。TdTomato在肺细胞中不表达。相反，tdTomato+神经纤维支配肺部。b条成人肺组织中的td番茄外荧光、CGRP和DAPI染色AdvillinCreER公司T2段;Ai9公司 +Tam公司报告鼠。TdTomato在NEB中不表达。斑点线划定了肺上皮。支气管、细支气管。c、 d日，td成人颈静脉-结节复合体中的番茄表观荧光(c（c）)成人胸部DRG的td番茄表观荧光和DAPI染色(d日)来自AdvilinCreer公司T2段;Ai9公司 +Tam公司报告鼠。TdTomato在颈静脉-结节复合体中表达(c（c）)和DRG(d日).e、 （f）肺组织中的td番茄表观荧光和DAPI染色(e（电子）)和颈静脉结节复合体(（f）)成人的PvalbCre；Ai9公司报告小鼠。TdTomato在肺细胞和颈静脉-结节复合体的神经元细胞体中不表达。比例尺，100µm。
扩展数据图8
扩展数据图8。各种呼吸特性压电陶瓷2-缺陷小鼠系
a、 b条，平均频率(一)和平均潮气量(b条)成人野生型和Phox2bCre；压电陶瓷2cKO公司处于麻醉状态的小鼠*P（P）<0.05，未成对学生t吨-试验，平均值±标准误差。c（c），成人野生型和AdvillinCreER公司T2段;压电陶瓷2cKO公司老鼠*P（P）<0.05，未配对韦尔奇t吨-试验，平均值±标准偏差。d、 e（电子），苯双胍（PBG）诱导成人化学反射AdvillinCreER公司T2段;压电陶瓷2cKO公司老鼠。野生型和AdvillinCreER公司T2段;压电陶瓷2cKO公司静脉注射2.0µg PBG的小鼠(d日). 注射PBG后的基线和最长呼吸间隔。条形代表平均值±标准误差(e（电子）).f、 克，平均频率(（f）)和平均潮气量(克)成人野生型和PvalbCre；压电陶瓷2cKO公司处于麻醉状态的小鼠。未付费学生的t吨-试验，平均值±标准误差。小时，成人野生型和PvalbCre；压电陶瓷2cKO公司老鼠。未准备好的韦尔奇t吨-试验，平均值±s.e.m.NS，无统计学意义。
扩展数据图9
扩展数据图9。压电陶瓷在呼吸系统中的作用
一，节点感觉神经元中的压电。据广泛报道，结节状感觉神经元含有低阈值机械感受器，支配包括肺在内的下呼吸道，而颈静脉感觉神经元含有高阈值机械感受者，支配上呼吸道，如喉和气管。此外，结节感觉神经元投射到NTS,是脑干Hering–Breuer反射所需的突触站。与这些发现一致，在颈静脉结节神经节复合体中检测到了Piezo2的表达，而Piezo2+神经纤维投射到NTS。此外，结节神经节中缺乏Piezo2的成年小鼠对肺膨胀的迷走神经反应消失，潮气量增加，Hering-Breuer吸气反射受损。除结节神经节外，Piezo2还表达于颈静脉、三叉神经和背根神经节。我们在成年小鼠的几乎所有感觉神经元中都观察到了类似的Piezo2缺失小鼠表型。这些数据表明，结节感觉神经元中的压电陶瓷是成年小鼠肺容量调节和Hering–Breuer反射反应所需的主要拉伸传感器。b条颈静脉、三叉神经和/或脊髓感觉神经元中的压电2。在新生小鼠中，神经嵴来源的感觉神经元中的Piezo2是适当的肺扩张和建立有效呼吸所必需的，因为整体Piezo2敲除和神经嵴来源的感觉神经元特异性Piezo2条件敲除新生小鼠都表现出通气不足、吸气活性降低，呼气模式改变和肺部扩张。我们的遗传学研究还表明，新生儿肺扩张和呼吸的结节性神经节中不需要Piezo2；然而，这种缺乏需求并不意味着缺乏参与，可能是由于功能冗余（即颈静脉、三叉神经和/或背根神经节中的Piezo2可以弥补结节神经节中Piezo2的缺陷）。虽然新生动物呼吸的感觉神经元控制在很大程度上尚不清楚，但新生气道在肺扩张过程中经历了很大的压力变化。气道的压电2介导的机械感觉反馈对随后的运动输出（例如，控制膈肌放电或防止上气道狭窄）以在新生动物中建立正确的呼吸模式至关重要。本文提供的数据并没有确定Piezo2缺陷新生儿死亡的确切原因；然而，我们推测幼崽的死亡可能是由于换气不足和因无法哺乳而缺乏营养的综合作用。c（c）NEB中的Piezo2。除了呼吸道神经支配的感觉神经元外，Piezo2也在肺NEB细胞中表达，这些细胞可能由Piezo2支配+传入神经（扩展数据图3b，箭头）。NEB是神秘的肺细胞，其生理功能尚不清楚,,先前的研究表明，引起Hering–Breuer反射的充气诱导迷走神经反应正在缓慢适应,,,当在培养细胞中进行分析时，压电2通道通常会快速适应，而皮肤中默克尔细胞-神经突起复合体中的压电2渠道会引起缓慢适应的放电反应,这可能是由表皮Merkel细胞和相关传入细胞中的双重Piezo2表达引起的,因此，NEB也可能与Piezo2一起有助于感知肺部充气+机械感觉传入。未来的研究将探索肺NEB是否像默克尔细胞一样起机械感觉细胞的作用。
图1
图1。观察到呼吸窘迫和死亡压电陶瓷2−/−新生小鼠
一，生存曲线。WT，野生型。b条，新生小鼠的代表性图片。箭头表示胃里有牛奶。c（c），%SpO2野生型和压电陶瓷2−/−新生小鼠***P（P）<0.001，Mann-Whitney检验。条形代表平均值±标准误差。d日–克，呼吸模式。d、 （f），呼吸气流的代表性痕迹（ml s−1). E、 到期；一、 灵感。e（电子），每分钟呼吸次数；克，%的灵感，然后是呼气峰*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未配对学生t吨-试验，平均值±标准误差。h–j小时左肺切片的血红素和曙红染色。出生后立即隔离肺部(小时)，出生后约6小时(我)或胚胎期（E）18.5(j个). 比例尺，100µm。括号中显示的动物数量。
图2
图2。组织特异性特征压电陶瓷2条件敲除（cKO）小鼠
一,b条,Tie2Core；压电陶瓷2cKO公司新生小鼠。c（c）,d日,Phox2bCre；压电陶瓷2cKO公司新生小鼠。e–j Wnt1核心；压电陶瓷2cKO公司新生小鼠。a、 c、e，%SpO2. **P（P）<0.01，Mann-Whitney检验。NS，统计上不显著。条形代表平均值±标准误差。b、 d、f左肺切片的血红素和曙红染色。右面板位于d日和（f）以红色显示Piezo2耗尽的组织。J，颈静脉神经节。N、 无糖神经节。g、 我，呼吸气流的代表性痕迹（ml s−1).小时，每分钟呼吸次数。j个，%的灵感，然后是呼气峰*P（P）<0.05，未成对学生(小时)或韦尔奇的(j个)t吨-测试，平均值±标准偏差。所有标尺，100µm。括号中显示的动物数量。
图3
图3。压电迷走感觉神经元的特性
a、 b条颈淋巴结（J–N）神经节复合体中的GFP免疫染色(一)和胸部DRG(b条)第页，共页压电陶瓷2GFP公司将DiO逆行示踪剂注射到气管下管腔的报告小鼠。黄色箭头标记GFP+DiO公司+细胞。对四只小鼠的样品进行了分析。比例尺，100µm。c（c），迷走神经对局部照明（蓝色阴影）的呼吸反应压电陶瓷2GFP公司;液氧-ChR2老鼠。通过记录气管压力测量呼吸节律（代表性轨迹，底部）。d日，10-s试验中光诱导的呼吸频率变化****P（P）<0.0001，未成对学生t吨-试验，平均值±标准偏差。
图4
图4。成人的呼吸特征
AdvillinCreER公司T2段;压电陶瓷2cKO公司老鼠。一左，肺充气时记录整个迷走神经。重复测量双向方差分析：基因型F类(1,18)= 8.077,P（P）= 0.0108; 空气流量F类(3,54)= 28.62,P（P）< 0.0001; 相互作用F类(3,54)= 6.372,P（P）= 0.0009. *P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，Sidak的事后检验；平均值±s.e.m.右侧，压电2缺失组织显示为红色。b–d段，麻醉下全身容积描记器记录。平均频率(b条)和平均潮气量(c（c）); *P（P）<0.05，未配对韦尔奇(b条)或学生的(c（c）)t吨-试验，平均值±标准误差。d日，呼吸气流的典型痕迹。E、 到期；一、 灵感。括号中显示的动物数量。
图5
图5。成人肺膨胀检测受损Phox2bCre；压电陶瓷2cKO公司老鼠。
a、 b条，整个迷走神经记录。一，代表性痕迹；b条，神经活动正常（平均值±标准偏差）。重复测量双向方差分析：基因型F类(1,10)= 18.93,P（P）= 0.0014; 空气流量F类(3,30)= 10.75,P（P）< 0.0001; 相互作用F类(3,30)= 13.94,P（P）< 0.0001. *P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，Sidak的事后测试。红色显示的压电缺失组织(b条，右）。c、 d日，肺膨胀时的呼吸模式。c（c），气管压力的典型痕迹。步骤表明诱导压力增加，每次偏转都是一次呼吸。d日，正常呼吸率（平均值±标准偏差）。重复测量双向方差分析：基因型F类(1,10)= 188.7,P（P）< 0.0001; 空气流量F类(3,30)= 97.48,P（P）< 0.0001; 相互作用F类(3,30)= 126.4,P（P）< 0.0001, ****P（P）<0.0001，Sidak的事后测试。括号中显示的动物数量。
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