Intrinsic cellular signaling mechanisms determine the sensitivity of cancer cells to virus-induced apoptosis

doi:10.1038/srep37213

.2016年11月16:6:37213。

doi:10.1038/srep37213。

内在细胞信号机制决定癌细胞对病毒诱导凋亡的敏感性

王云飞^1 2, 李大伟^1 三, 罗健（Jian Luo）¹, 田桂梅¹, Lisa Y Zhao（丽莎·Y·赵）¹, 廖代青¹

附属公司

¹美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学医学院UF遗传研究所UF健康癌症中心解剖与细胞生物学系。
²西北农林大学生命科学学院生物化学与分子生物学系陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌。
^三山东大学齐鲁医院泌尿科，山东济南。

PMID： 27849011
预防性维修识别码： PMC5111159
DOI（操作界面）： 10.1038/代表37213

内在细胞信号机制决定癌细胞对病毒诱导凋亡的敏感性

王云飞等。科学代表. 2016.

.2016年11月16:6:37213。

doi:10.1038/srep37213。

作者

王云飞^1 2, 李大伟^1 三, 罗健（Jian Luo）¹, 田桂梅¹, Lisa Y Zhao（丽莎·Y·赵）¹, 廖代青¹

附属公司

¹美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学医学院UF遗传研究所UF健康癌症中心解剖与细胞生物学系。
²西北农林大学生命科学学院生物化学与分子生物学系陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌。
^三山东大学齐鲁医院泌尿科，山东济南。

PMID： 27849011
预防性维修识别码： PMC5111159
DOI（操作界面）： 10.1038/报告37213

摘要

上皮和间充质表型的癌细胞对凋亡刺激表现出不同的敏感性，但这一现象背后的机制仍有部分了解。我们构建了一种表达Ad12 E1A（Ad-E1A12）的新型重组腺病毒，该腺病毒能强烈诱导细胞凋亡。Ad-E1A12感染的上皮癌细胞表现出明显的脱落和凋亡，而具有转移倾向的间充质表型的癌细胞对这种病毒的抵抗力明显增强。值得注意的是，上皮细胞的强制分离并没有进一步使其对Ad-E1A12诱导的凋亡敏感，这表明细胞分离是Ad-E1A1诱导凋亡的结果，而不是原因。Ad-E1A12通过不同细胞类型中的独立机制增加AKT1和核糖体蛋白S6的磷酸化。Ad-E1A12诱导的AKT1磷酸化在上皮癌细胞中是PI3K依赖性的，在间充质癌细胞中则是mTOR依赖性的。由于AKT1降解，Ad-E1A12诱导的脱落后的上皮癌细胞不能维持AKT激活，但间充质癌细胞中保持AKT1激活。间充质细胞中上皮细胞限制性miR-200家族的表达限制了mTOR信号传导，并使其对Ad-E1A12诱导的细胞杀伤敏感。因此，上皮癌细胞依赖典型的PI3K-AKT信号通路生存，而间充质癌细胞则部署PI3K-非依赖性mTORC2-AKT轴以响应强烈的死亡刺激。

PubMed免责声明

数字

**图1。Ad-E1A12诱导细胞自发脱落和凋亡。**
(A类)Ad-E1A12的矢量结构。(B类)Western blotting检测MDA-MB-468细胞中E1A12、Ad5-DBP和病毒衣壳的表达。(C类)在MDA-MB-468细胞中复制Ad-eGFP（复制缺陷）、Ad-E1A12和wt-Ad5的病毒基因组。用qPCR测定48hpi时病毒DNA的相对丰度。(天)Ad-E1A12感染后MDA-MB-468细胞的自发脱离。未感染MDA-MB-468细胞和感染Ad-eGFP或Ad-E1A12的细胞的显微照片。还显示了感染Ad-eGFP或Ad-E1A12的细胞培养物的荧光图像。(E类)流式细胞术评估Ad-E1A12对MDA-MB-468细胞凋亡的诱导作用。绘制了含有亚G1 DNA含量的细胞百分比。(F类)未感染MDA-MB-468细胞和感染Ad-eGFP、Ad-E1A12和Ad5 wt的细胞在48hpi时的典型细胞周期特征。(**G公司**)感染Ad-E1A12的MDA-MB-468细胞的半胱氨酸蛋白酶激活。用caspase-Glo评估caspase活性^®MDA-MB-468细胞中3/7检测系统（Promega），未感染（对照）、感染Ad-eGFP、Ad-E1A12或野生型Ad12病毒（Ad12 wt）*第页 < 0.05, **第页 < 0.01（与对照，学生t检验）；ns：无统计学意义。H、 Ad-E1A12诱导的细胞死亡与细胞分离无关。MDA-MB-468细胞未感染，或感染了Ad-eGFP或Ad-E1A12。重新接种细胞4 h感染后常规96-well钢板（“附着”）或超低附着96-weall钢板（“分离”）。使用CellTiter-Glo在48 h感染后。这个第页根据Student的t检验显示两两比较的值。

**图2。基质分离细胞的蛋白质降解。**
(A类)MDA-MB-468细胞未感染或感染了指示的病毒。蛋白酶体抑制剂MG132添加到20 微米6 如图所示，细胞裂解前h。使用针对指示蛋白质的抗体在48hpi下裂解细胞进行Western印迹。(B类)Ad-E1A12感染对YAP1磷酸化的影响。MDA-MB-468细胞按面板（A）处理。使用针对所示蛋白质的抗体进行蛋白质印迹。注意，使用了与面板a中用于检测E1A的抗体不同的抗体。该抗体还检测到Ad5 E1A。(C类)癌细胞分离后细胞蛋白的下调。将所示的癌细胞系进行胰蛋白酶化，然后立即裂解（d）或直接裂解于平板（a）上。用针对所示蛋白质的抗体对裂解产物进行免疫印迹。(天)使用从模拟处理或感染指示病毒的MDA-MB-468细胞中分离的RNA对指示基因进行定量实时PCR（qRT-PCR）。所示为三个生物复制的平均值（根据ACTB mRNA水平进行标准化）以及平均值的标准误差（误差条）*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,*不另说明。*：不具体（vs.模拟，学生t-test）。

**图3。PI3K抑制抑制上皮癌细胞中Ad-E1A12诱导的AKT1磷酸化，但不抑制S6磷酸化。**
(A类)MDA-MB-468细胞未感染或感染所示病毒（100 vps/细胞）。DMSO或同等体积的GDC-0941添加至0.1 微米2 在指定车道添加病毒后h。24点用针对所示蛋白的抗体对hpi细胞进行Western印迹。(B类)抑制Ad-E1A12感染的MDA-MB-468细胞的细胞生存途径。MDA-MB-468细胞按A组处理。所示药物添加至0.1 微米。48岁时用针对所示蛋白的抗体对hpi细胞进行Western印迹。(C类)LNCaP细胞未受感染（模拟）或感染了越来越多的Ad-E1A12（每组从左到右为10、100、1000 vps/细胞）。在面板中添加药物(B类). 在48hpi时收集细胞进行Western blotting。

**图4。Ad-E1A12对AKT和mTOR信号的PI3K非依赖性激活。**
MDA-MB-231细胞用所指示的病毒（100vps/细胞）感染。然后将细胞暴露于0.1的指示抑制剂中 μM（LY294002为1 μM）。这些抑制剂对JAK2（LY2784544）、PI3K的所有亚型（GDC-0941）、mTORC1和mTORC2（AZD8055）、PI3G/mTOR1/mTORC2、mTORC（替米莫司）和PI3K（LY294002）具有特异性。细胞在24时被裂解高性能指数(A类)或48hpi(B类). 用针对所示蛋白质的抗体对裂解产物进行蛋白质印迹分析。

**图5。Ad-E1A12激活PC-3细胞中PI3K非依赖性AKT和mTOR信号。**
PC-3细胞被指示的病毒感染（100 vps/细胞）。感染细胞用二甲基亚砜或一种指定的抑制剂在0.1 微米。细胞在48hpi条件下进行裂解，用针对所示蛋白的抗体进行Western blotting分析。

**图6。Ad-E1A12抑制MDA-MB-468异种移植的肿瘤生长，但不抑制MDA-MB-231异种移植。**
将MDA-MB-468细胞与Matrigel或MDA-MB-231细胞注射到雌性NU/NU小鼠的侧翼，建立异种移植物。两次注射病毒（1 × 10⁹每次注射vps），持续三周。治疗终点用箭头表示。肿瘤体积(A类,E类)和体重百分比变化(B类和F类)所示为荷瘤小鼠。典型肿瘤的图像(C类)和组织化学染色(天)MDA-MB-468的异种移植瘤。每个治疗组有5只小鼠。

**图7。miR-200的异位表达抑制AKT/mTOR信号传导，并恢复对Ad-E1A12诱导的细胞死亡的敏感性。**
用携带表达盒的慢病毒载体稳定地转导MDA-MB-231细胞*miR-200c-141-GFP*或*miR-200b-200a-429-GFP*集群。(A类)将转导的细胞感染指示的病毒，并在48hpi下收获进行Western blotting。(B类)在不存在或存在指示的抑制剂（0.1 μM）。96岁时测定细胞活力马力。根据病毒剂量（平均值 ± 扫描电镜，n = 3). (C类)显示了亲本和转导的MDA-MB-231细胞的代表性图像。还显示了转导细胞GFP场的相应显微照片。

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