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.2016年9月8日5:2269。
doi:10.12688/f1000research.8156.1。 2016年eCollection。

Mecp2 A140V Rett综合征小鼠模型中神经元大小和mTOR通路活性降低

Sampathkumar Rangasamy公司 1, 香农·奥尔弗斯 2, 布列塔尼·杰拉尔德 3, 亚历克斯·希尔伯特 4, 肖恩·斯韦达 1, 维诺德·纳拉亚南 5
附属公司

Mecp2 A140V Rett综合征小鼠模型中神经元大小和mTOR通路活性降低

Sampathkumar Rangasamy公司等。 F1000分辨率. .

摘要

Rett综合征（RTT）是一种由X连锁基因突变引起的神经发育障碍MECP2型基因，编码甲基-CpG-结合蛋白2。我们已经创建了一个鼠标模型(机械2表达复发人类的A140V“敲入”突变体MECP2型A140V突变与X连锁精神发育迟滞/Rett综合征表型相关。对突变体的初级海马和小脑颗粒神经元（CGN）培养物进行形态学分析，重点是量化胞体和细胞核大小(机械2A140伏/年)和野生型(机械2+/年)雄性小鼠。突变动物培养的海马和小脑颗粒神经元明显小于野生型动物的神经元。我们还检测了表达突变（母体等位基因）和野生型的单个雌性转基因小鼠海马神经元的胞体大小机械2与eGFP转基因相关的基因（父系等位基因）。在来自这种双杂合雌性小鼠的培养物中，与表达野生型MeCP2的神经元相比，表达突变（A140V）等位基因的神经元的大小也显示出显著减少，支持MeCP2在神经元发育中的细胞自主作用。IGF-1（胰岛素生长因子-1）治疗来自机械2突变小鼠挽救了体细胞大小表型。我们还发现机械2 突变导致mTOR信号通路的下调，已知mTOR信号通路参与神经元大小调节。我们的结果表明，i）神经元尺寸减小是一个重要因素在体外细胞表型机械2小鼠中的突变，以及ii）MeCP2可能通过调节mTOR通路在维持神经元结构中发挥关键作用。可量化细胞表型的定义支持将神经元大小作为高通量开发中的生物标记，在体外用于筛选拯救小神经元表型的化合物的分析（“表型分析”）。

关键词：小脑颗粒神经元；海马神经元培养；IGF-1；MECP2；神经元核大小；神经元胞体大小；雷特综合征；利克托；mTOR途径。

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数字

图1。
图1.繁殖产生雌性Mecp2 A140V:X-EGFP复合杂合子。
从雌性Mecp2 A140V X-EGFP复合杂合子（A140V：X-EGFP）制备原代神经元培养物，用于分析单个盖玻片中突变型和野生型神经元的神经元胞体大小。
图2。
图2培养海马神经元的体细胞大小。
用针对神经元特异性标记物β-III Tubulin（Tuj-1）的抗体对神经元进行染色。使用图像分析软件测量体细胞大小，定义为神经元体周围轮廓的横截面积。使用40 X物镜获得了具有代表性的共焦图像。免疫荧光图像显示：A类)野生型神经元，以及B类)MeCP2 A140V神经元。(C类)DIV 3和21野生型和突变神经元胞体大小的量化（平均值±SEM，*，p<0.05，Student t检验）。
图3。
图3海马和小脑颗粒细胞中的神经元胞体和核大小分布。
平均神经元胞体(A类)和核能(B类)突变体和野生型海马细胞大小为5DIV。海马体的频率分布(C类)和核能(天)突变体和野生型的大小差异显著（p<0.01）。平均CGN神经元胞体(E类)和核能(F类)突变型和野生型动物的大小为5 DIV。CGN胞体的频率分布(天)和核能(E类)突变型和野生型的面积差异显著（p<0.05）。
图4。
图4杂合雌性A140V小鼠的神经元胞体大小。
(A类)来自Mecp2 A140V:X-eGFP小鼠大脑冠状切片的海马齿状回共焦图像。用抗NeuN（红色）和抗GFP（绿色）染色显示嵌合体。(B类)将雌性Mecp2 A140V:X-eGFP小鼠的海马神经元分离并培养在一张盖玻片中。在DIV 3用抗β-III Tubulin（Tuj-1）（红色）和抗GFP（绿色）对神经元进行染色，并测量体横截面积。MeCP2 A140V神经元不表达GFP，仅用TuJ-1染色（红色），而野生型神经元的神经元同时用GFP和TuJ-1染色（绿黄色）。所有共焦图像均采用20X物镜拍摄。(C类)量化这些镶嵌培养物中野生型和突变神经元的神经元胞体大小（平均值±SEM，*，p<0.05，Student’s t检验）。
图5。
图5用IGF-1治疗神经元培养物可挽救小神经元表型。
将来自Mecp2 A140V雄性动物的原代海马培养物用IGF-1（100 ng/ml）在3 DIV上处理24小时。用抗β-III Tubulin（Tuj-1）对神经元进行染色，并测量神经元的横截面积。使用20倍物镜获得了具有代表性的共焦图像。免疫荧光图像显示(A类)未经处理的神经元和B类)用IGF-1治疗神经元。C类)对未经IGF-1治疗和经IGF-1治疗的突变神经元的神经元胞体大小进行量化，结果显示突变神经元的神经胞体得到拯救。（平均值±SEM，*，p<0.05，学生t检验）。
图6。
图6.Mecp2 A140V突变动物mTOR途径的改变。
A类)用抗利肌、猛禽和总mTOR抗体同时检测野生型和突变型小鼠全脑裂解物的蛋白质印迹。Tubulin被用作负荷控制，以使蛋白质表达正常化，并扫描图像并量化蛋白质水平。B类)图中显示，与对照动物相比，在将β-III微管蛋白水平归一化为正常水平后，突变动物的蓖麻蛋白水平显著降低（每个n=3）（平均值±扫描电镜，*p<0.05，学生t检验）。C类)对16周龄突变和野生型小鼠的全脑裂解液进行蛋白质印迹分析，检测磷酸化mTOR（S2448和S2481）、磷酸化S6核糖体蛋白、4E-BP1和磷酸化GSK-3β水平。为了避免对磷酸化形式的检测造成干扰，在分离的膜上检测了一些蛋白质。使用免疫印迹法，我们评估了总蛋白和磷酸化蛋白水平。Tubulin被用作所有面板中的适当负载控制。(天)磷酸化mTOR（pS2481）和(E类)与对照动物相比，突变动物的磷酸化4E-BP1蛋白水平（每个n=4）（平均值±SEM，*p<0.05，Student’s t检验）。
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