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.2016年9月；18(9):553-66.
doi:10.1016/j.neo.2016.07.007。

DNMT1调节上皮-间充质转化和肿瘤干细胞促进前列腺癌转移

恩索尔·李 1, 王靖诚 1, 副理事长汤元健治 1, Younghun Jung先生 1, 弗兰克·C·卡考夫斯基 2, 安·M·德克尔 1, 阎丽 1, 雷尼·T·弗朗西斯科 三, 肯尼思·皮恩塔 4, 罗素·S·泰奇曼 5
附属公司

DNMT1调节上皮-间充质转化和肿瘤干细胞促进前列腺癌转移

恩索尔·李等。 肿瘤形成. 2016年9月.

摘要

肿瘤转移是一个多步骤的过程，与上皮-间充质转化（EMT）和肿瘤干细胞（CSC）的诱导有关。虽然在理解调控EMT和CSC表型的分子机制方面取得了重大进展，但对于这些过程是如何被表观遗传学调控的，我们知之甚少。在这里，我们证明DNA甲基转移酶1（DNMT1）的表达降低在前列腺癌（PCa）细胞诱导EMT和CSC表型中起着重要作用，从而增强肿瘤的发生和转移。首先，我们观察到，5-azacitidine（5-Aza）降低DNMT1可促进EMT诱导以及体外CSC和球体形成。DNMT1表达减少显著增加PCa迁移潜能。我们表明，通过减少DNMT1增加EMT和CSC活性与蛋白激酶C的增加有关。此外，我们证实，沉默DNMT1与增强PCa细胞中EMT的诱导和CSC表型有关。此外，染色质免疫沉淀分析显示，DNMT1的减少促进了PCa细胞中Zeb2和KLF4启动子区H3K9me3和H3K27me3的抑制。至关重要的是，我们在动物模型中发现，注射5-Aza预处理的PCa细胞后，大多数骨组织中观察到显著的肿瘤生长和更多播散的肿瘤细胞，而不是注射载体预处理的PCa细胞。我们的结果表明，由DNMT1减少调节的组蛋白去甲基化的表观遗传改变可能控制EMT和CSC表型的诱导，从而促进PCa细胞的肿瘤发生，并在靶向表观遗传调控方面具有重要的治疗意义。

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数字

图1
图1
DNMT1的减少促进PCa细胞EMT的诱导。PCa细胞（PC3或DU145）（1×105)在6孔培养板中接种。用载体或5-Aza（0-20μM）处理细胞4天。（A） 实时PCR定量检测载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞（PC3或DU145）中DNMT1表达的mRNA水平。以人前列腺上皮细胞RWPE-1作为对照。（B） 载体或5-Aza（5μM）处理后PCa细胞（PC3或DU145）中DNMT1的蛋白质水平通过Western blots定量。（C） 通过实时PCR定量的载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞（PC3或DU145）中EMT标记物的mRNA水平。（D） 免疫荧光染色检测载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞（PC3或DU145）中E-Cadherin或N-Cadhein的表达。蓝色，DAPI核染色。巴=20μm。（E） Western blots定量的载体或5-Aza（5μM）处理PCa细胞（PC3或DU145）中的EMT标记物。（F） 在Transwell平板中，将载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞迁移至趋化剂CXCL12。顶部腔室中初始细胞数的迁移百分比设置为100%。A、C和F中的数据代表平均值±SD(n个 = 6).P（P）值由Student的t吨测试。
图2
图2
DNMT1的减少刺激PCa细胞中CSC的转变。CSC（CD133+/CD44细胞+通过FACS分析评估载体或5-Aza（5μM）处理的（A）PC3细胞或（B）DU145细胞的表型。（C） 免疫荧光染色检测到CD133（红色）和CD44（绿色）在载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞中的共表达。蓝色，DAPI核染色。棒材=20μm。（D）体外载体或5-Aza处理PCa细胞的前列腺形成（bar=20-50μm）和（E）图2的量化D类（F）通过Western blots定量的干细胞相关转录因子。A、B和E中的数据代表平均值±SD(n个 = 6).P（P）值由Student的t吨测试。
图3
图3
PKCα与PCa细胞中DNMT1介导的EMT和CSCs相关。PCa细胞（PC3或DU145）（1×105)接种在6孔培养板中，用载体或5-Aza（5μM）处理细胞4天。通过（A）ELISA定量的PKC激酶活性（数据代表平均值±SD；学生的t吨试验）和（B）PKCα蛋白表达，通过Western blots定量。载体或5-Aza（5μM）中（C）PKCα、（D）Zeb2和（E）KLF4表达的mRNA水平，存在或不存在泛PKC抑制剂Go6983（类别A8343；ApexBio，休斯顿，TX 77054）处理PCa细胞（PC3或DU145）4天，通过实时PCR定量。A、C、D和E中的数据代表平均值±SD(n个 = 3).P（P）值由Student的t吨测试。
图4
图4
沉默DNMT1与PCa细胞EMT诱导和干细胞相关。用靶向DNMT1的siRNA瞬时转染PCa细胞（PC3或DU145）并培养72小时。（A） 实时PCR定量的对照组或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）中DNMT1的mRNA水平。（B） 通过Western blots定量的对照组或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）中DNMT1的蛋白质水平。（C） Western blots定量的对照组或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）中的EMT标记物。（D） 通过趋化性分析对DNMT1沉默的PCa细胞进行迁移。（E） CSC人群（CD133+/CD44细胞+表型），通过FACS分析评估来自对照或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）。A、D和E中的数据代表平均值±SD(n个 = 6).P（P）值由Student的t吨测试。（F） Western blots定量的对照或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）中的干细胞相关转录因子。（G） 蛋白印迹定量的对照组或DNMT1沉默的PCa细胞（PC3或DU145）中的PKCα。实时PCR定量显示在存在或不存在pan-PKC抑制剂的对照或DNMT1沉默PCa细胞（PC3或DU145）中3天内（H）PKCα、（I）Zeb2和（J）KLF4表达的mRNA水平。H、I和J中的数据代表平均值±SD(n个 = 3).P（P）值由Student的t吨测试。
图5
图5
DNMT1的减少诱导PCa细胞中Zeb2或KLF4启动子的组蛋白去甲基化。（A） 5-Aza或siDNMT1处理的PCa细胞中CHIP qPCR检测的实验设计。（B） 一个方案显示了人类Zeb2或KLF4基因座转录起始位点启动子区域的引物位点。通过CHIP qPCR分析（C）在载体或5-Aza（5μM）处理的PCa细胞（PC3，DU145）和（D）在siControl或siDNMT1处理的PCa细胞（PC2，DU145）中Zeb2基因组位点H3K9me3和H3K27me3水平的各自输入百分比。通过CHIP qPCR分析（E）在载体或5-Aza处理的PCa细胞（PC3，DU145）和（F）在siControl或siDNMT1处理的PCa细胞（PC2，DU145）中KLF4基因组位点H3K9me3和H3K27me3水平的各自输入百分比。C–F中的数据代表平均值±SD(n个 = 3).P（P）值由学生的t吨测试。（G） 总图显示5-Aza或siDNMT1处理后H3K9me3和H3K27me3的组蛋白去甲基化激活染色质，导致Zeb2和KLF4转录增加。
图6
图6
DNMT1减少刺激PCa转移。表达GFP的PCa细胞（PC3GFP公司或DU145GFP公司)用载体或5-Aza（5μM）预处理4天后，将皮下注射到5至7周龄雄性SCID小鼠体内(n个=8/组）。4周后，处死小鼠。在由（A–C）PC3细胞或（D–F）DU145细胞产生的肿瘤中显示出肿瘤生长。Bar=10 mm。（G和H）通过实时PCR对许多组织中的Alu进行转移评估。*表示P（P）Student’s预处理的PCa细胞与5-Aza预处理的细胞之间<.05t吨测试(n个 = 5). （一） 皮下注射后，在SCID小鼠的股骨中发现了表达GFP的PCa细胞。绿色箭头表示PCa细胞。红色箭头表示骨表面成骨细胞CXCL12表达阳性。棒材=50μm。（J） I的定量。对长骨骨内端PCa细胞的数量进行定量。骨内区域定义为距离骨表面10个或10个以下的细胞直径。数据代表平均值±SD(n个=8/组）。P（P）值由Student的t吨测试。
图7
图7
皮下PCa肿瘤和人类原发性PCa肿瘤中DNMT1减少与Zeb2、N-Cadherin或KLF4的相关性。（A） 免疫荧光共染色检测到载体中DNMT1（红色）表达细胞或5-Aza预处理的s.c.PCa肿瘤中的Zeb2（绿色）、N-Cadherin（绿色）或KLF4（绿色）表达（白色箭头）。蓝色，DAPI核染色。棒材=20μm。（B） A.数据的量化表示平均值±SD(n个=8/组）（学生的t吨测试）。（C） 免疫荧光共染色检测PCa患者TMA样本中DNMT1（红色）表达细胞中的Zeb2（绿色）、N-Cadherin（绿色）或KLF4（绿色）表达（白色箭头）。蓝色，DAPI核染色。棒材=20μm。TMA是正常前列腺组织(n个=8），Gleason 6 PCa组织(n个=9）和Gleason 9 PCa组织(n个 = 5). （D） C.数据的量化表示平均值±SD（学生t吨测试）。
图8
图8
实验模型。5-Aza处理降低DNMT1表达或沉默DNMT1诱导PCa细胞EMT和CSC表型在体外导致原发肿瘤内的肿瘤发生和骨转移。
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