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.2016年10月15日；129(20):3911-3921.
doi:10.1242/jcs.190702。 Epub 2016年9月2日。

神经毛蛋白-1调节脑微血管内皮细胞中γ-干扰素刺激的信号

王颖（音） 1, 颖曹 1, 阿舒托什K曼加拉姆 2, 永国 三, 雷根·拉弗朗西·科里（Reghann G LaFrance-Corey） 三, 杰弗里·加麦斯 三, 帕斯卡尔·阿利赫努伊·阿坦加 三, 本杰明·D·克拉克森 三, 张月波 4, 王恩峰 1, 拉姆查兰·辛格·安戈姆 1, 基尔西娅·杜塔 1, 宝安记 4, 伊斯特万·皮尔科 三, 克劳迪娅·卢奇内蒂（Claudia F Lucchinetti） 三, 查尔斯·L·豪 三, Debabrata Mukhopadhyay公司 5
附属公司

神经毛蛋白-1调节脑微血管内皮细胞中γ-干扰素刺激的信号

王颖（音）等。 细胞科学杂志. .

摘要

血脑屏障（BBB）内皮细胞的炎症反应在许多中枢神经系统炎症疾病的发病机制中起着重要作用，包括多发性硬化；然而，介导BBB内皮细胞炎症反应的分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们首次观察到，敲除神经纤维蛋白-1（NRP1），一种多种结构多样配体的共同受体，以Rac1依赖性方式抑制干扰素-γ（IFNγ）诱导的脑微血管内皮细胞中C-X-C基序趋化因子10的表达和STAT1的激活。此外，内皮特异性NRP1基因敲除小鼠、VECadherin-Cre-ERT2/NRP1flox/flox公司在实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种小鼠神经炎症模型）期间，小鼠的疾病进展减弱。利用组织学染色、定量PCR、流式细胞术和磁共振成像进行的详细分析表明，内皮NRP1的缺失抑制了神经元脱髓鞘，改变了淋巴细胞浸润，保留了BBB功能，并降低了STAT1-CXCL10通路的激活。此外，在急性多发性硬化病变的内皮细胞中观察到NRP1的表达增加。我们的数据通过NRP1-IFNγ串扰确定了脑微血管内皮炎症反应的新分子机制，该机制可能是神经炎症疾病中内皮细胞功能障碍干预的潜在靶点。

关键词：脑微血管内皮细胞；炎症反应；干扰素-γ；神经炎性疾病；神经纤毛蛋白-1。

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数字

图1。
图1。
敲除NRP1抑制IFNγ刺激的CXCL10表达和STAT1激活。另请参见图S1和S2系列（A）用对照siRNA（Csi）或针对NRP1（Nsi）的siRNA转染HBMVEC，然后暴露于重组IFNγ（10 天然气 毫升−1)24小时 h.使用qPCR定量CXCL10的表达，并将其表达为对照组的相对倍，标准化为1。n个=每组5人。（B） 用对照siRNA（Csi）或NRP1 siRNA（Nsi）转染HBMVEC 24小时 h，然后用IFNγ（10）刺激 天然气 毫升−1)用于15 收集总蛋白裂解物，并用所示抗体进行免疫印迹。结果代表了五个独立实验。柱状图显示了STAT1的激活，以磷酸化（p）STAT1与总STAT1之比表示，并与对照组进行了比较，后者标准化为1。（C） 在用对照siRNA（Csi）或NRP1 siRNA（Nsi）转染24小时的HBMVEC的裂解物中检测Rac1的活性 h并用IFNγ（10）刺激 天然气 毫升−1)用于15 最小结果代表三个独立实验。对蛋白质印迹进行扫描、分析，并在图S2（D）HBMVEC用Rac1抑制剂NSC 23766（NSC）预处理1 h，然后用IFNγ（10）刺激 天然气 毫升−1)24小时 h.提取总RNA，并使用针对CXCL10和β-actin基因的引物进行qPCR分析。CXCL10的表达水平报告为对照组的相对倍数，标准化为1。n个=每组4人。（E） HBMVEC感染了表达Rac1 61L或LacZ的慢病毒作为24例对照 h，然后用对照siRNA（Csi）或NRP1 siRNA（Nsi）转染24小时 h.用IFNγ（10）刺激后收集总蛋白裂解物 天然气 毫升−1)用于15 min，并对指示的蛋白质进行western blotting。条形图显示了以pSTAT1与总STAT1之比表示的STAT1的激活，并将这些值与对照组的值进行了比较，这些值被标准化为1。n个=每组4人*P（P）<0.05; NS，无显著性。使用非参数Mann-Whitney检验来比较对照siRNA组和NRP1 siRNA组之间的差异。数据以平均值±s.e.m表示。
图2。
图2。
内皮NRP1基因敲除调节EAE中的炎症反应。另请参见图S2和第3章（A）蛋白裂解物来自WT和VECad/NRP1脊髓−/−（KO）小鼠17 在EAE诱导后第天，对指示的蛋白质进行western blotting。（B） 在17岁时从正常小鼠和小鼠身上采集脊髓 天，然后进行qPCR。n个=4，对于正常小鼠和n个EAE组为6。（C） 免疫组织化学检测CXCL10在WT和VECad/NRP1小鼠脊髓中的表达−/−（KO）小鼠17 EAE诱导后第天。每组五只动物的五个样本的结果具有代表性。比例尺：20 微米。（D） 13岁时采集脊髓过滤白细胞 EAE诱导后第天，用流式细胞仪进行分析。D中的三个右条形图代表不同的细胞群。在右边的图表中，数据表示为平均±95%置信区间。左侧显示了具有代表性的流式细胞仪图。n个=每组5人。（E，F）脊髓收获17 EAE诱导后第天，每根脊髓切10–12片，固定，包埋在石蜡块中，并进行Luxol-Fast-Blue和周期酸-Schiff（LFB/PAS）染色（F）和苏木精-伊红（H&E）染色（E）。每组五只小鼠的代表性图像显示在E和F中。比例尺：200 µm（顶板）；20 µm（底板）。对LFB/PAS染色图像进行盲法评分、量化和比较（G）。n个=每组5人。E和F中的矩形表示炎症细胞浸润和脱髓鞘病变，并在底部显示为放大图像。（H） WT小鼠脊髓与VECad/NRP1−/−17岁时收获（KO）小鼠 EAE诱导后第天进行qPCR分析。数据表示为对照组数值的相对倍数（平均值±标准偏差），并归一化为18S核糖体RNA（18S）的表达。n个=每组5人*P（P）<0.05，双尾未配对学生t吨-测试用于图2B、G、H中的分析。
图3。
图3。
内皮NRP1缺失保留BBB功能 在期间 EAE公司。另请参见图S4（A，B）FITC–向WT（VECad/NRP1）注射溶解在PBS中的白蛋白+/+)小鼠和KO（VECad/NRP1−/−)通过尾静脉注射的室友2 14时杀戮前h EAE诱导后第天。采集脊髓并进行冰冻切片（A）和抗闭塞素抗体（红色）免疫荧光染色（B）。n个=4，对于WT组和n个KO组为5。比例尺：500 µm（A）；10 微米（B）。将（C–E）FITC–白蛋白注入Tie2-Cre−/尼泊尔卢比1絮状物/重量（第2级/NRP1+/+)小鼠和Tie2-Cre+/尼泊尔卢比1f/重量（第2级/NRP1+/−)小鼠尾静脉注射2 杀戮前h 21 EAE诱导后第天。每根脊髓的一半进行冰冻切片。比例尺：200 微米（C）。采集每根脊髓的另一半，均质并分析FITC-白蛋白的荧光强度，将其归一化为血清中的荧光强度并表示为对照组（D，Tie2/NRP-1）的相对水平（平均值±标准偏差）+/+). 用抗闭塞素抗体（红色）对冰冻切片进行免疫荧光染色。用DAPI（E，蓝色）对细胞核进行复染。n个=每组3个（C–E）。面板D显示了使用双尾未配对学生的分析t吨-测试*P（P）<0.05.
图4。
图4。
内皮NRP1的缺失抑制EAE的疾病进展。另请参见图S4.（A–C）四周WT（VECad/NRP1+/+)小鼠和KO（VECad/NRP1−/−)窝友连续5天灌胃给予他莫昔芬。然后，用MOG免疫这些小鼠35–55肽后于10时腹腔注射百日咳毒素（PTX） 周龄。监测行为评分（A）和体重（B）。数据表示为平均±95%置信区间。疾病发病率（C）表示为患病小鼠在总人口中的百分比。n个=42（WT组），n个=36对于VECad/NRP1−/−组（D）。WT小鼠和VECad/NRP1小鼠大脑的T2*加权MRI图像−/−14岁的老鼠 EAE诱导后第天。D中的箭头表示WT小鼠小脑中的局灶性高强度损伤。结果代表每组三只动物。在A、B、，P（P）由于空间有限，<0.01用*表示，并使用双尾双向方差分析进行分析。
图5。
图5。
内皮NRP1在人类急性多发性硬化病变中诱导。（A） 正常人扁桃体组织中NRP1的免疫组织化学分析显示，NRP1在内皮细胞中表达强烈。图像是三种技术复制的代表。（B） 正常人脊髓标本在软脑膜下区显示出有限的NRP1免疫反应。放大图（插图）显示NRP1+胶质细胞。（C） 正常人脑白质无NRP1信号。放大图显示NRP1−内皮细胞。（D） KIM1P免疫组织化学染色的低倍图像显示多发性硬化脑白质中广泛的巨噬细胞浸润。（E） 多发性硬化组织切片上的Luxol Fast Blue和碘酸-Schiff（LFB-PAS）染色显示白质中有破坏性脱髓鞘病变（如蓝色虚线所示）。（F） 图D的放大图显示了具有大量巨噬细胞浸润的感兴趣区域（KIM1P染色）。（G） 髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）与F所示区域相同，表明早期活跃的脱髓鞘活动，以髓磷脂碎片和巨噬细胞为特征（插图放大）。（H） D-G（NRP1染色）显示病变区反应性星形胶质细胞和内皮细胞中NRP1免疫反应增强。结果代表了正常人脑和多发性硬化病变（B-H）的三个样本。H的放大图显示内皮细胞中NRP1的阳性染色。比例尺：20 微米（A、B、H），50 微米（C、F、G），1 毫米（D，E）。
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