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.2015年9月14日：15030。
doi:10.1038/cddiscovery.2015.30。 2015年电子收集。

ALS相关突变型FUS抑制通过过度表达Rab1恢复的大自噬

K Y Soo先生 1, J苏丹 2, A E国王 三, 拉克·阿特金森 三, S T Warraich公司 2, V Sundaramoorthy公司 2, 我是布莱尔 2, M A Farg公司 1, J D阿特金 2
附属公司

ALS-相关突变体FUS抑制通过Rab1过度表达恢复的大自噬

K Y Soo先生等。 细胞死亡发现. .

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）的特征是运动神经元中形成的细胞内错误折叠蛋白内含物。自噬是溶酶体内易聚集蛋白的主要降解途径。自噬开始于产生ω体，形成自噬体膜，然后与溶酶体融合。融合肉瘤（FUS）突变导致5%的家族性ALS病例，FUS阳性包涵体也在散发性ALS组织中形成。在本研究中，我们证明ALS-相关突变FUS的表达会损害神经元细胞的自噬。在表达FUS的突变神经元细胞中，检测到泛素化蛋白和自噬底物p62和NBR1的积累，并且在这些细胞中抑制了omegasome和自噬体的形成。然而，Rab1的过度表达挽救了这些缺陷，表明Rab1对ALS具有保护作用。与对照组患者相比，携带FUS（R521C）突变的ALS患者脊髓运动神经元中LC3阳性小泡的数量也增加，这进一步证明了突变FUS相关ALS中的自噬失调。这项研究进一步了解了ALS复杂的自噬系统和神经变性。

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数字

图1
图1
mFUS的过度表达抑制自噬。(一)联合转染HA-FUS（WT或突变）和HttQ74-GFP构建物的Neuro2a细胞18的代表性图像 h.固定细胞，使用抗HA抗体进行免疫细胞化学，然后进行共焦显微镜检查。比例尺=10 μ米(b条)含HttQ74内含物的转染细胞百分比的量化(一),n个=3.Untr代表未转染细胞。(c（c）)使用抗HA和抗LC3抗体对表达Neuro2a细胞的HA-FUS（WT或突变体）可溶性细胞裂解物进行免疫印迹。去除污渍，并用β-肌动蛋白作为加载控件。使用巴非霉素A1（Baf）处理的细胞作为对照。(d日)通过免疫印迹定量LC3-II的相对强度(c（c）)，正常化为未转染细胞，n个=5. (e（电子）)联合转染HA-FUS（WT或突变）和Dsred-LC3的Neuro2a细胞18的代表性图像 h.白色箭头表示LC3-阳性囊泡。比例尺=10 μ米(（f）)细胞数量(e（电子）)含有>5个LC3阳性囊泡，n个=3. (克)用HA-FUS（WT或突变体）转染Neuro2a细胞18 h.然后用巴非霉素（100）处理转基因细胞 nM））再增加6 h.收集细胞裂解物，并使用抗LC3抗体进行免疫印迹。去除污渍并重新处理β-肌动蛋白作为负荷控制。(小时)通过免疫印迹定量LC3-II的相对强度(克)从用Bafilomycin处理过的正常化为未转染细胞的细胞，n个=4. (我)表达HA-FUS（WT或突变）的Bafilomycin处理的Neuro2a细胞的透射电镜图像。箭头表示自噬液泡。比例尺=2 μ米(j个)量化每个样本共20个细胞中每个细胞的自噬空泡数，n个=2.平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.0001时***P（P）<0.00001与Untr公司，# P（P）<0.05,## P（P）<0.0001与重量。
图2
图2
mFUS的过度表达抑制泛素化蛋白的清除。(一)mFUS过度表达对p62水平的影响。EGFP-p62和EGFP（1.5 : 1） 在Neuro2a细胞中与HA-FUS（WT或突变体）共转染18 h.EGFP被用作EGFP-p62转染效率的对照。收集细胞裂解物并使用抗GFP抗体进行免疫印迹。(b条)通过免疫印迹定量EGFP-p62的相对强度(一)，正常化为未转染细胞，n个=5. (c（c）)将HA-FUS（WT或突变体）和Dsred-LC3联合转染Neuro2a细胞18 h.然后固定细胞，并使用抗NBR1抗体进行免疫细胞化学。显示了显示LC3和NBR1共同本地化的合并图像和插图。比例尺=10 μ米(d日)LC3和NBR1共定位的囊泡百分比定量，n个=3.在每次实验中，对大约10到20个细胞进行评分。平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05, ***P（P）<0.00001与Untr公司，### P（P）<0.00001与重量。
图3
图3
在表达mFUS的细胞中，自溶体的形成受到抑制。(一)将HA-FUS（WT或突变体）和mCherry-GFP-LC3联合转染Neuro2a细胞18 h后使用共焦显微镜进行检查。白色箭头表示mCherry-LC3（表示溶酶体）。比例尺=10 μ米(b条)用mCherry-LC3定量来自每个样品的至少10个细胞的囊泡的百分比，n个=3. (c（c）)SHSY5Y细胞与HA-FUS（WT或突变型）和pcDNA-LAMP2C载体共转染18个 h.收集细胞裂解物，并使用抗LAMP2抗体进行免疫印迹。去除污渍并用β-肌动蛋白作为加载控件。(d日)LAMP2相对强度的量化(c（c）)，正常化为未转染细胞，n个=2.平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.0001与Untr公司，## P（P）<0.0001,### P（P）<0.00001与重量。
图4
图4
mFUS抑制ATG9向自噬体的募集和omegasomes的形成。(一)将HA-FUS（WT或突变体）和Dsred-LC3联合转染Neuro2a细胞18 h.固定细胞，并使用抗ATG9抗体进行免疫细胞化学。显示了合并图像和插图，展示了Dsred-LC3和ATG9之间的共同定位。比例尺=5 μ米(b条)使用ATG9和LC3之间的Mander共定位度系数进行量化。每个样本共分析了20个细胞，n个=2.平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试***P（P）<0.00001与Untr公司，# P（P）<0.005,### P（P）<0.00001与重量(c（c）)将Neuro2a细胞与HA-FUS（WT或突变体）和myc-DFCP1共转染18 h.固定细胞，并使用抗HA和抗myc抗体进行免疫细胞化学。然后用DAPI对细胞进行复染以识别细胞核。白色箭头表示欧米伽小体形成。比例尺=10 μ米(d日)每一个细胞中形成的ω形体数量的量化(c（c）). 在每个样品中总共分析了20个细胞，n个=3.平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05, ***P（P）<0.00001与Untr公司，## P（P）<0.0001与重量。
图5
图5
表达mFUS的初级皮质神经元中形成的自噬体和ω体较少。(一)用HA-FUS（WT或突变体）和Dsred-LC3共转染原代皮层神经元18 h.然后使用抗HA抗体进行免疫细胞化学。白色箭头表示自噬体的形成。比例尺=10 μ米(b条)每一初级神经元形成的自噬体数量的量化(一),n个=3. (c（c）)将HA-FUS（WT或突变体）和EGFP-DFCP1共同转染初级皮层神经元18 h.然后使用抗HA抗体进行免疫细胞化学。白色箭头表示欧米伽小体形成。比例尺=10 μ米(d日)每一初级神经元形成的ω体数量的量化(c（c）),n个=3.平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05, ***P（P）<0.00001与Untr公司，# P（P）<0.05,### P（P）<0.00001与重量。
图6
图6
Rab1过度表达可在表达mFUS的细胞中恢复自噬体、omegasome和自溶体的形成。(一)Neuro2a细胞与HA-FUS（WT或突变体）、Dsred-LC3和CFP-Rab1载体（或CFP空载体）共转染18 h.比例尺=10 μ米(b条)Neuro2a细胞与HA-FUS（WT或突变型）、myc-DFCP1和CFP-Rab1（或CFP空载体）载体共转染18个 h.比例尺=10 μ米(c（c）)细胞百分比的量化(一)每个细胞含有>5个LC3小泡，n个=3. (d日)每一个细胞中ω染色体数量的量化(b条),n个=3. (e（电子）)将HA-FUS（WT或突变体）、mCherry-GFP-LC3和CFP-Rab1载体（或CFP空载体）联合转染Neuro2a细胞18 h.比例尺=10 μ米(（f）)定量每个样品的至少10个细胞中具有mCherry-LC3信号的囊泡的百分比，n个=3.平均值±S。E.M.双配对学生t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.0001, ***P（P）<0.00001.
图7
图7
Rab1过度表达抑制mFUS向SG的募集，并减少形成的SG的大小。(一)用HA-FUS（WT或突变体）转染Neuro2a细胞18 h.用抗TIAR抗体固定细胞并进行免疫染色，用DAPI进行复染以鉴定细胞核。显示HA、TIAR和DAPI之间的合并图像。白色箭头表示SG。比例尺=10 μ米(b条)定量显示FUS和TIAR共定位的细胞百分比，表明FUS向SG招募，n个=3. (c（c）)Neuro2a细胞与HA-FUS（WT或突变）和CFP-Rab1载体（或CFP空载体）共转染18 h.用抗HuR抗体固定细胞并进行免疫染色，用DAPI进行复染以鉴定细胞核。显示HA、HuR和DAPI之间的合并图像。白色箭头表示SG。比例尺=10 μ米(d日)FUS和HuR共定位的细胞数量，表明FUS向SG招募，n个=3. (e（电子）)量化形成的每个SG的大小(μ米2). 每个样本中至少有40个SG对SG的大小进行评分，n个=3.平均值±S。E.M.双配对学生t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.0001时***P（P）<0.00001.
图8
图8
携带R521C FUS突变的ALS患者运动神经元中LC3阳性小泡增多。(一)人死后脊髓切片的免疫组织化学（5 μm） 来自FUS突变R521C ALS患者和使用抗LC3抗体的对照病例。比例尺=40 μ米(b条)每个患者总共40个运动神经元中LC3阳性囊泡的数量被量化，n个=40。平均值±S。E.M.与Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试*P（P）<0.05.
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参考文献

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