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.2016年9月；64(9):1532-45.
doi:10.1002/glia.23020。 Epub 2016年6月29日。

微波固定小鼠脑内糖原分布显示异质性星形细胞模式

Yuki Oe公司 1, 奥托·巴巴 2, 芦田均 三, Kouichi C Nakamura公司 4, Hajime Hirase先生 1 5
附属公司

微波固定小鼠脑内糖原分布显示异质性星形细胞模式

大江由纪等。 格利亚. 2016年9月.

摘要

在大脑中，糖原代谢被暗示为突触可塑性和学习，但这种分子的分布尚未完全描述。我们使用两种单克隆抗体通过免疫组织化学（IHC）研究了小鼠的脑糖原，这两种单克隆抗体根据糖原的大小具有不同的亲和力。与传统的周期性酸-希夫法相比，聚焦微波辐射产生了明确的糖原免疫反应信号。IHC信号呈点状分布，主要局限于星形细胞突起。糖原免疫反应性（IR）在海马、纹状体、皮质和小脑分子层中较高，而在白质和大部分皮层下结构中较低。此外，海马CA3-CA1和纹状体中的糖原分布呈“斑块状”，糖原丰富的星形胶质细胞和糖原贫乏的星形胶质胶质细胞交替出现。糖原斑块在年轻成年小鼠的大分子糖原中更明显，但在老年小鼠（1-2岁）中几乎看不到。我们的结果揭示了大脑区域依赖性糖原积累和星形胶质细胞可能的代谢异质性。GLIA 2016；64:1532-1545.

关键词：老化；星形胶质细胞；聚焦微波辐射；糖原；免疫组织化学。

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数字

图1
图1
糖原IHC使用IV58B6和ESG1A9抗体。(A类)糖原抗体亲和力示意图。(B类)两种不同安乐死方法对糖原IHC的比较：聚焦微波辐射辅助固定（见方法）与.灌注固定。IV58B6（IV）和ESG1A9（ESG）抗体均经过小鼠背海马CA1的IHC。科科斯群岛胼胝体、SO地层oriens，SP金字塔层、SR放射层. (C类)CA1糖原IHC放大图放射层从点状的红盒子里(B类)采用与（B）中相同的布置。(D类)通过生化测定法比较全脑糖原含量。（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 6, ***P（P） < 0.001，未配对t检验）。(E类)微波固定（上部）和灌注固定（下部）海马CA1切片的PAS染色。点区域在右侧面板中放大。箭头指向糖原样颗粒，在PAS染色中显示为更强烈的斑点。(F类)淀粉酶消化的海马CA1切片未用IV58B6或ESG1A9标记。比例尺：（B）200μm；（C） 50微米；（E） 200微米；（左）20μm（右）；（F） 100微米。[可在在线期刊上查看彩色图片，网址为wileyonlinelibrary.com.]
图2
图2
糖原在大脑中的全脑分布。(A类)IV58B6（左）和ESG1A9（右）对糖原IHC进行冠状切片。(B类)IV58B6（上部）和ESG1A9（下部）的糖原IHC矢状切面。对大脑不同脑区的相对IV58B6 IR进行冠状动脉评估(C类)和矢状的(D类)截面（平均值 ± SEM）。这些比较用图形表示(E类)和(F类). (G公司)微波固定皮层、海马、纹状体和小脑的糖原测定。注意小脑化验同时包含小脑皮层和白质（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 7, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001，采用Tukey HSD测试的单向方差分析）。PAS染色部分的荧光图像(H（H）)与MBP IHC进行比较(我)标记髓磷脂。比例尺：（A）、（B）、（H）和（I）1 mmwileyonlinelibrary.com.]
图3
图3
在大脑不同区域点状糖原IR。(A类)不同脑区的共焦图像显示糖原IR与IV58B6（左）和ESG1A9（右）抗体。(B类)IV58B6的双IHC，带有CA1中星形胶质细胞（GFAP）、小胶质细胞（Iba1）或神经元（NeuN）的细胞类型特异性标记s.r公司. (C类)ESG1A9的双IHC带有细胞类型特异性标记，如（B）所示。IV58B6对糖原IR的细胞类型依赖性定位(D类,F类、和H（H）)或ESG1A9(E类,G公司、和我)通过计算糖原IR到CA1中相应细胞类型特异性标记物（星形胶质细胞，GFAP；小胶质细胞，Iba1；神经元，NeuN；少突胶质细胞，MBP）的面积分数进行检测s.r公司（D和E）、大脑皮层（F和G）和胼胝体（H和I）（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 7-11只动物，n个 = 140张图片*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001，采用Tukey HSD测试的单向方差分析）。比例尺：（A）60μm；（B和C）30μm。
图4
图4
皮质和海马星形胶质细胞中糖原的亚细胞分布。(A类和B类)顶叶皮质（A）和海马（B）第1层表达EYFP的星形胶质细胞与IV58B6（上排）和ESG1A9（下排）糖原免疫荧光的共焦图像。通过给GLAST‐CreERT×Rosa26‐LSL‐EYFP小鼠服用三苯氧胺，诱导了稀疏星形胶质细胞群中EYFP-的表达。比例尺：（A和B）20μm。(C类–F类)用两种方法分析EYFP标记的皮质星形胶质细胞中的亚细胞糖原分布；糖原点状密度（颗粒/μm2; C和D）和糖原免疫荧光面积分数（%；E和F）。蓝色和红色条形图分别表示IV58B6和ESG1A9数据的分析。（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 5只动物，n个 = 45张图片*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001，采用Tukey HSD测试的单向方差分析）。(G公司–J型)海马中糖原亚细胞分布分析，以与（C–F）相同的方式进行（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 5只动物，n个 = 47张图片*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001，采用Tukey HSD测试的单向方差分析）。
图5
图5
大脑皮层中的糖原分布。(A类)顶叶结合皮质的IV58B6糖原IHC（中间）与相邻节段的NeuN IHC一起显示，用于神经元胞体分布（左侧）。IV58B6标记的伪彩色图像显示在右侧。(B类)跨顶叶结合皮层皮层层IV58B6信号强度的比较（平均值 ± 扫描电镜，N个 = 9, *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001，采用Tukey HSD测试的单向方差分析）。(C类)细胞色素c氧化酶染色（CO）（左侧，亮度和对比度调整）和IV58B6 IHC（中间）在初级体感皮层的桶区的比较显示，糖原分布中缺乏明显的第4层（红色虚线之间）桶结构。IV58B6标签的伪彩色图像显示在右侧。(D类)IV58B6在初级视觉皮层、初级运动皮层和前额叶皮层（PrF）的IR模式。一般趋势是，表层产生的信号高于深层，如（B）所示，顶叶结合皮层。比例尺：（A、C和D）100μm。
图6
图6
糖原在海马中的分层和斑片状分布。糖原IHC（通过IV58B6）(A类)和ESG1A9(B类)海马CA1和齿状回。在合并面板（右侧）中，NeuN（左侧）和糖原（中间）信号分别显示为红色和绿色。SO公司地层oriens，SP金字塔层、SR放射层、SLM分子腔隙层，DGML‐U齿状石膏分子层上叶片，DGGL‐U齿状石膏颗粒层上叶片门DGML‐L齿状石膏分子层下叶片，DGGL‐R齿状石膏颗粒层下叶片。IV58B6的层依赖性糖原IR信号谱(C类)和ESG1A9(D类). 定量糖原IHC的信号强度(N个 = 5） 以CA1锥体细胞层为参考（平均值 ± SEM）。(E类和F类)来自CA1的图像s.r公司显示IV58B6（左）和ESG1A9（右）进行自相关分析。2D自相关图显示在每张显微照片的右侧。高相关性区域和低相关性区域交替出现，表明呈斑片状分布。ESG1A9的斑块分布更为明显。图片取自三只动物。绿色圆圈和黄色圆圈分别对应于“补丁内”和“补丁外”区域。(G公司)纹状体中的片状糖原分布和2D自相关图。(H（H）)大脑皮层L2/3的类似分析，未观察到斑块状分布。（A）和（B）中的图像比例相同。（E–H）中的组织学图像（上排）具有相同的比例，2D自相关图（下排）轴上的数字以μm为单位。比例尺：（A和B）100μm；（H） 50微米。
图7
图7
片状结构由单个星形胶质细胞组成。(A类)海马CA1中的ESG1A9糖原IHC（绿色）s.r公司.用GFAP复染（红色）。一些星形胶质细胞在ESG1A9标记的糖原中含量明显较低，标记为黄色圆圈。(B类)富含ESG1A9的星形胶质细胞示例。GLAST‐CreERT×Rosa26‐LSL‐EYFP小鼠用于在稀疏的星形胶质细胞群中诱导EYFP表达。绿线表示EYFP表达和富含ESG1A9的星形胶质细胞的边界。(C类)例如，来自（B）中相同小鼠的ESG1A9缺失星形胶质细胞。黄线代表EYFP表达和ESG1A9缺乏的星形胶质细胞的边界。糖原的积累依赖于单个星形胶质细胞，而不依赖于EYFP的表达。（B）和（C）中的图像比例相同。比例尺：（A）100μm和（C）20μm。
图8
图8
随着年龄增长，糖原分布呈斑块状减少。(A类)显示年轻成年（9-12周龄）和老年（1岁）小鼠海马的IV58B6和ESG1A9糖原IHC。斑片状分布在年轻成年小鼠中是明显的，而IV58B6信号模式在老年小鼠中更平滑，ESG1A9信号在很大程度上减少。此外，在老年小鼠中可以观察到异常的糖原积累，即多糖体（箭头所示）。(B类)来自（A）中相同动物的纹状体糖原IHC图像。年龄更大的小鼠海马的ESG1A9糖原IHC[(C类)1.5岁(D类)2岁]。衰老小鼠的图像显示，斑块状分布明显减少，多糖的出现频率随年龄增加而增加。(E类)CA1的2D自相关s.r公司计算了一只年轻成年小鼠和一只1.5岁小鼠的。二维自相关图轴上的数字以μm为单位。比例尺：所有比例尺均为500μm。老年人（2岁）的IV58B6被均匀染色，类似于（A，右上图）。(F类)对年轻成年和老年（2岁）小鼠海马的糖原进行生化评估。在这两个年龄组中，测得的糖原量相似。[可在在线期刊上查看彩色图片，网址为wileyonlinelibrary.com.]
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参考文献

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