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.2016年5月；37(5):1263-73.
doi:10.3892/ijmm.2016.2519。 Epub 2016年3月8日。

基底膜结构的异常促使增生性瘢痕表皮中的基底角质形成细胞采用增殖表型

杨少伟 1, 孙业晓 2, 耿志军 2, Kui Ma公司 2, 孙晓燕 1, 傅晓兵 1
附属公司

基底膜结构的异常促使增生性瘢痕表皮中的基底角质形成细胞采用增殖表型

杨少伟等。 国际分子医学杂志. 2016年5月.

摘要

大多数关于瘢痕形成的研究主要集中在真皮，而对表皮的影响知之甚少。以往的研究表明，瘢痕组织来源的角质形成细胞在遗传和细胞生物学水平上都不同于正常细胞；然而，瘢痕形成过程中角质形成细胞基本异常的机制尚不清楚。为此，在本研究中，我们使用正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织来检查作为伤口愈合过程的一部分的表皮再生过程中发生的形态学变化，发现增生性疤痕组织的组织结构不同于正常皮肤，表皮厚度显著增加。值得注意的是，瘢痕组织中似乎没有基底膜染色。此外，细胞角蛋白（CK）10、CK14、CK5、CK19和整合素-β1的免疫荧光染色显示，正常组织、伤口边缘组织和增生性瘢痕组织中表皮角质形成细胞中细胞标记物的差异表达与BM结构的改变相一致。通过使用与BM组分相关的一组蛋白质，我们验证了我们的假设，即BM在皮肤伤口愈合期间对表皮角质形成细胞的细胞命运决定起着重要的调节作用。BM结构的改变促进基底角质形成细胞在体内和体外采用增殖表型。

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图1
图1
正常、创伤边缘和增生性瘢痕组织之间的形态学差异。（A–C）苏木精和伊红（H&E）染色以可视化正常组织、伤口边缘和瘢痕组织的组织结构。（A） 在正常皮肤样本中，可以看到皮肤的组织结构，显示出表皮和真皮层。表皮含有4至5层角质形成细胞。在真皮下层，成纤维细胞构成松散的结缔组织，其中富含平行胶原纤维（D）。插图显示了黑色标记内区域的特写视图。黑色三角形表示真皮，而粉红色三角形表示表皮。橙色箭头表示网脊。红色箭头表示基底角质形成细胞。蓝色箭头表示棘细胞。黄色箭头表示颗粒细胞。绿色箭头表示角质化细胞。（B） 在伤口边缘组织样本中，表皮增生，厚度增加，由形态各异的多层角质形成细胞组成。红色箭头表示基底角质形成细胞，其排列为一层规则的立方或低柱状细胞。（C） 增生性瘢痕组织的组织结构与正常皮肤不同，其血供丰富，间充质密度高，表皮层厚。真皮主要由致密、无组织的结缔组织组成，其中包括形状不规则、直径较大的坚韧胶原纤维。（D–F）Masson染色显示胶原纤维在（D）正常组织、（E）伤口边缘和（F）瘢痕组织中的分布。棕色箭头表示具有丰富血液供应的坚韧胶原蛋白。（G–I）甲基烯胺银染色用于检测（G）正常组织、（H）伤口边缘和（I）疤痕组织中的基底膜（BM）结构。BM存在于正常组织和伤口边缘组织中，但在瘢痕组织中不存在。（G和H）黑色箭头表示BM。所有比例尺代表50μ米。
图2
图2
正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织表皮角质形成细胞中的细胞标记物表达。典型荧光图像显示CK10、CK14、CK5、CK19和整合素β1在正常组织、伤口边缘和瘢痕组织切片中的定位。（A–C）CK10是分化角质形成细胞的标记物，表达于（A）正常组织和（B）伤口边缘组织的表皮外层，以及（C）增生性瘢痕组织表皮的基底上终末分化细胞。（D–F）CK14在三种组织的复层表皮的基底层和基底层上均表达。特别是，CK14在瘢痕组织的多层表皮中广泛分布。（G–I）CK5的分布模式与CK14相似，这表明过度增殖的表皮中增殖细胞数量增加。（J–O）CK19和整合素-β1在（J和M）正常表皮基底层、（K和N）伤口边缘表皮基底层和基底上层表达，但在增生性瘢痕组织的（L和O）表皮中未检测到。白色虚线表示分隔表皮和真皮的基底膜。插图显示了白色标记内区域的特写视图。所有比例尺代表25μm.（P）正常、创面边缘和增生性瘢痕组织基底层和基底层上CK19表达细胞的统计分析。数据为平均值±SD。**P<0.01。
图3
图3
基底膜成分在正常、创伤边缘和增生性瘢痕组织中的不同分布模式。（A–C）典型荧光图像，显示IV型胶原在正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织中的分布模式。在（A）正常组织和（B）伤口边缘组织的BM区均检测到IV型胶原的表达。然而，增生性瘢痕组织的（C）表皮无IV型胶原染色。（D–F）典型荧光图像，显示层粘连蛋白在正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织中的分布模式。（G-I）典型荧光图像显示层粘连蛋白-5和整合素-β4在正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织中的定位。（I）增生性瘢痕组织中层粘连蛋白-5和整合素-β4均呈阴性染色，（G）正常组织和（H）伤口边缘组织中层黏连蛋白-5、整合素β4呈阴性染色。白色虚线表示分隔表皮和真皮的基底膜。插图显示了白色标记内区域的特写视图。所有比例尺代表25μ米。
图4
图4
典型的荧光图像显示正常、伤口边缘和增生性瘢痕组织中层粘连蛋白-5和整合素-β4的双重标记。（A–I）在（A–C）正常和（D–F）伤口边缘皮肤组织的基底膜（BM）区域检测到层粘连蛋白-5和整合素-β4的分布。（G-I）在增生性瘢痕组织的表皮中，观察到在缺乏层粘连蛋白5和整合素β4表达的情况下，BM样结构的形成。白色虚线表示分隔表皮和真皮的基底膜。所有比例尺代表25μ米。
图5
图5
细胞外基质（ECM）涂层调节表皮角质形成细胞中细胞角蛋白（CK）10、CK14和CK19的表达在体外人基底膜（BM）提取衍生ECM用于缩小BM结构在体外（A和B）具有代表性的荧光图像，显示整合素-β4（绿色）在（A）人表皮角质形成细胞（HEKs）和（B）有或无ECM涂层的人永生化角质形成上皮细胞（HaCaT）中的定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。所有比例尺代表25μm.（C）有或无ECM涂层的HEKs和HaCaT细胞中整合素-β4表达的Western blot分析。（D–I）在原代培养的HEKs和HaCaT细胞被切换到含有1.5 mM Ca的培养基中2+在指定的时间段内，通过实时qPCR评估CK10、CK14和CK19表达的相对水平。钙2+以时间依赖性方式诱导表皮细胞系中（D和G）CK10和（E和H）CK14的表达，在1.5 mM Ca后24 H达到峰值表达水平2+（D和E）HEKs和（G和H）HaCaT细胞的治疗。然而，ECM治疗降低了与钙相关的角质形成细胞的分化反应2+给予（F）HEKs和（I）HaCaT细胞，并在Ca后12 h和24 h增强CK19的表达2+添加。数据为平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，ns=不显著。（J） 对有或无ECM涂层的HEK和HaCaT细胞中CK10、CK14和CK19的表达进行Western blot分析。
图6
图6
表皮细胞分化模型的建立在体外将人表皮角质形成细胞（HEKs）和人永生角质化细胞（HaCaT）细胞切换到含有1.5 mM Ca的培养基中2+在指定的时间段内生成分化的表皮细胞。Ca后（A）HEKs和（B）HaCaT细胞的形态学变化2+将细胞切换到含有1.5 mM Ca的培养基后，分别处理0、12和24小时2+，（A）HEKs和（B）HaCaT细胞都变大变平。所有比例尺代表100μm.（C和D）RT-qPCR检测Ca后（C）HEK和（D）HaCaT细胞CK10、CK14和CK19的表达2+在指定的时间段内进行治疗。我们的数据显示Ca2+治疗以时间依赖性的方式上调表皮角质形成细胞中CK10和CK14 mRNA的水平，而CK19的mRNA水平在钙的作用下显著降低2+刺激。**P＜0.01。
图7
图7
IV型胶原涂层调节表皮角质形成细胞CK10、CK14和CK19的表达在体外（A–F）为了进一步确定基底膜（BM）在表皮角质形成细胞行为调节中的潜在作用，使用IV型胶原形成BM样结构在体外将人表皮角质形成细胞（HEKs）和人永生角质化细胞（HaCaT）细胞切换到含有1.5 mM Ca的培养基2+通过RT-qPCR评估CK10、CK14和CK19表达的相对水平。尽管Ca2+IV型胶原处理降低了（A和B）HEKs和（D和E）HaCaT细胞中CK10和CK14的mRNA表达，这与（A和D）CK10和（B和E）CK14在表皮细胞系中的表达呈时间依赖性。IV型胶原治疗也增加了（C）HEKs和（F）HaCaT细胞中CK19的mRNA水平在体外数据为平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，ns，不显著。（G） Western blot分析经或不经IV型胶原处理的HEKs和HaCaT细胞中CK10、CK14和CK19的表达。
图8
图8
基底膜（BM）在皮肤伤口愈合中维持基础角质形成细胞功能的调节作用示意图。（A） 在正常皮肤中，BM分离表皮和真皮，并在真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞之间的细胞和分子通讯中发挥关键调节器的作用。基底层的干细胞能够在一生中自我更新，并产生经过分化的子细胞[转运扩增细胞（TA）]。基底角质形成细胞通过半桥粒和粘附分子（如整合素）附着于BM。（B） 一旦皮肤受伤，基底角质形成细胞就会被激活并迁移到伤口区域。BM不仅是一种结构支架，而且有助于皮肤表皮基底层中表皮祖细胞的招募。表皮祖细胞在基底层的招募有助于在创伤修复和再生过程中保持基底角质形成细胞更新和分化之间的平衡。然而，BM结构的改变减少了基底祖细胞与周围微环境的粘附，并诱导它们分化和采用增殖表型，这可能是瘢痕形成的始发因素之一。
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