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。2016年5月1日；76(9):2720-30.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-2137。 Epub 2016年3月16日。

HSP70抑制抑制FAK依赖性侵袭并增强BRAF抑制剂治疗黑色素瘤的反应

安娜·布迪娜·科洛米斯 1, 玛丽·韦伯斯特 2, 朱莉娅·朱·洛伊 三, 马修·詹尼斯 1, 克莱门斯·克雷普勒 1, Anastasia游击队 1, 安德鲁·科斯森科夫（Andrew V Kossenkov） 4, 魏旭 5, Giorgos Karakousis公司 6, 林恩·舒赫特 5, 拉维·K·阿马拉瓦迪 5, 洪武 7, 襄樊尹 1, 秦柳 1, 陆一玲 8, 戈登·米尔斯 8, 徐晓伟 9, 唐娜·L·乔治 三, 阿沙尼·T·维拉拉特纳 2, 莫林·E·墨菲 10
附属公司

HSP70抑制抑制FAK依赖性侵袭并增强BRAF抑制剂治疗黑色素瘤的反应

安娜·布迪娜·科洛米斯等。 癌症研究。 。

摘要

应激诱导伴侣蛋白HSP70（HSPA1）与黑色素瘤的发展有关，HSP70抑制剂在癌症中发挥肿瘤特异性细胞毒活性。在这项研究中，我们记录了很大一部分黑色素瘤表达高水平的HSP70，特别是在晚期，并且磷酸化-FAK（PTK2）和BRAF是HSP70的客户蛋白。用HSP70抑制剂治疗黑色素瘤细胞可降低磷酸化-FAK水平，并在体内外损害迁移、侵袭和转移。此外，HSP70抑制因子PET-16可降低突变BRAF的水平，与BRAF抑制剂PLX4032在体外协同作用，这些发现为HSP70抑制作为黑色素瘤的治疗策略提供了有力支持，特别是作为一种辅助方法，克服黑色素瘤患者经常观察到的对BRAF抑制剂的耐药性。癌症研究；76(9); 2720-30. ©2016 AACR版权所有。

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利益冲突声明

潜在利益冲突的披露

作者声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1。HSP70在黑色素瘤中过度表达，对黑色素瘤的进展/预后起作用，并作为黑色素瘤肿瘤发生的驱动因素
A.通过免疫组化HSP70分析204例黑色素瘤患者和77例良性痣患者组织芯片样本的数据描述。HSP70免疫染色在良性痣和黑色素瘤中的差异是显著的（p＜0.0004）B。HSP70染色的阴性（0，痣）和阳性样本（评分为100、200和300）的例子。样本以盲法染色和评分。C.黑色素瘤和良性痣HSP70的散点图分析，TMA评分为0-300。采用Wilcoxon秩和检验比较所有黑色素瘤和痣的TMA评分。D.TMA对不同阶段黑色素瘤（痣、原位黑色素瘤、侵袭性黑色素瘤和转移性黑色素癌）的HSP70评分。Cuzik趋势检验用于检查TMA评分在恶性程度上的趋势。HSP70表达增加，恶性程度增加，呈阳性趋势（p<0.0001）。用单独载体或CMV驱动的HA标记HSP70稳定转染E.Yumm1.7细胞。将等量的混合转染细胞皮下注射到C57Bl/6小鼠的侧面，并随时间评估肿瘤体积。平均肿瘤体积随时间变化；n=5只小鼠/细胞系。这些数据代表了每个细胞系的两个独立克隆的结果。误差线表示标准误差。插图：HSP70的Western分析，使用HA抗体和HSP70抗体。F.第20天Yumm1.7-vector和Yumm170-HPS70细胞系最终肿瘤重量的散点图分析。误差条表示测量的标准误差。G.（E，F）中描述的小鼠分离肿瘤中Ki67和Cleaved Caspase 3的免疫组织化学染色。所示样本代表多个独立肿瘤。比例尺=100μm。
图2
图2。phospho-FAK（p-FAK，Y397）和BRAF作为新型HSP70“客户”蛋白的鉴定
A.WM793和1205Lu细胞（突变BRAF）用DMSO或用指示浓度的PET-16处理24小时，然后进行RPPA分析。热图显示了PET-16治疗后黑色素瘤相关蛋白的表达水平显著降低。A、 B和C是来自三个独立实验的单独样本。B.黑色素瘤细胞系1205Lu、WM793和WM852用二甲基亚砜或20μM PET-16处理48小时。然后对全细胞裂解物进行BRAF和p-FAK的免疫印迹分析。GAPDH包含在装载控制中。BRAF和p-FAK水平的密度定量如下所示。C.用二甲基亚砜或1μM PET-16处理WM793和WM852细胞24小时后进行免疫荧光分析，用p-FAK抗血清（Y-397）进行免疫染色，然后进行荧光二次染色，以及荧光标记的卵磷脂（红色）和DAPI（蓝色）。比例尺=100μm。D.用FAK抗体（左表）、BRAF抗体（右表）或等量IgG免疫沉淀，然后对1205Lu细胞中相关HSP70水平进行西方分析。E.用HSP70抗体或等量IgG进行免疫沉淀，然后对1205Lu细胞中相关FAK和BRAF水平进行西方分析。
图3
图3。HSP70抑制剂PET-16抑制黑色素瘤的迁移和侵袭
A.1205Lu细胞接种后形成融合单层。用移液管尖端刮伤细胞，用DMSO或1μM PET处理，然后在0、12、24和48小时成像。比例尺=100μm。B.DMSO与PET-16处理细胞在0、12、24、48小时时（A）中划痕闭合百分比的量化。所示数据表示三个独立实验的综合结果。误差条表示平均值的标准误差。C.用二甲基亚砜或指示剂量的PET-16预处理1205Lu细胞24小时跨孔迁移分析的代表性图像。将等量的细胞加载到跨孔的上腔中，孵育24小时，并在膜的下表面对迁移的细胞进行染色和成像。比例尺=100μm。D.生成由正常人成纤维细胞、1205Lu黑色素瘤细胞和正常人角质形成细胞组成的器官型3D皮肤重建，并用DMSO或0.5μM PET-16处理1周。显示了经二甲基亚砜或PET-16处理的黑色素瘤细胞的代表性苏木精和伊红（H&E）染色。比例尺=100μm。E.使用ImageJ软件，以皮肤-表皮交界处为起点，在每个皮肤重建的五个随机区域中测量（D）中1205Lu黑色素瘤细胞的侵袭深度。误差线表示标准偏差。F.用二甲基亚砜或指示剂量的PET-16预处理1205Lu和WM852细胞24小时后的Boyden室侵袭试验。将等量的细胞接种在Boyden室中并培养24小时；侵入Matrigel的细胞被染色。比例尺=100μm。G.每个实验组在五个不同的区域评估（F）的侵入细胞数，并取平均值。所有数值均归一化为DMSO对照；数据是三个独立实验的平均结果。误差线表示标准偏差。
图4
图4。FAK是PET-16抑制黑色素瘤侵袭能力所必需的
A.Western blot分析感染慢病毒控制载体（shControl）或针对FAK的短发夹（shFAK）的1205Lu细胞的总FAK水平。GAPDH的级别起到了装载控制的作用。B.用二甲基亚砜或0.5μM PET-16处理24小时的（A）中描述的1205Lu细胞的博伊登室侵入测定。将等量的细胞接种在Boyden室中并培养24小时。24小时后，侵入Matrigel的细胞被染色。比例尺=100μm。C.每个实验组在五个不同的区域中量化（B）中入侵细胞的数量，并取平均值。数据是三个独立实验的平均结果。误差条表示标准误差。在载体和shFAK细胞系中，PET-16抑制侵袭的百分比差异非常显著（p=0.005）。
图5
图5。HSP70抑制剂PES-Cl和PET-16对肿瘤转移的抑制作用
A.转移检测的示意图。用DMSO或3μM PES-Cl或PET-16预处理B16-F10细胞24小时。24小时后，通过活/死试验和2.5×10监测细胞的生存能力4将活细胞注入C57Bl/6小鼠尾静脉。在第7天，开始每周用指定剂量的PES Cl和PET-16进行治疗。3周后，评估小鼠肺部是否存在转移性结节。B.使用载体、PES-Cl或PET-16治疗后C57Bl/6小鼠肺转移的代表性图像（顶面板）和苏木精-伊红染色（底面板）。比例尺=100μm。C.来自B的数据的图形表示，其中以盲法对肺转移进行评分（n=10只小鼠/组）。D.（A）中描述的小鼠肺部磷酸-FAK（pTyr-397）的免疫荧光分析。比例尺=15μm。
图6
图6。HSP70抑制剂PET-16作为单一药物治疗黑色素瘤有效，并与BRAF抑制剂Vemurafenib协同作用
A.在使用Vemurafenib治疗之前和出现耐药性（治疗后）之后，对5个不同匹配的黑色素瘤患者样本进行HSP70免疫组织化学染色。红色斑点=HSP70。根据HSP70的强度和表达该蛋白的细胞数量，对（A）样本中HSP70表达进行评分。采用配对t检验比较治疗前后HSP70染色。C.用二甲基亚砜或指定剂量的PET-16、PLX4032或PET-16:PLX4022组合（摩尔比10:1）处理72小时的1205Lu黑色素瘤细胞的细胞活性分析。所示数据是3个独立实验的平均结果。误差线表示标准偏差。D.用二甲基亚砜或指定剂量的PET-16、PLX4032或PET-16:PLX4022组合（摩尔比10:1）处理72小时的WM35黑色素瘤细胞的细胞生存能力分析。所示数据是3个独立实验的平均结果。误差线表示标准偏差。E.采用PET-16和PLX4032组合，以固定的10:1摩尔比对1205Lu、WM35、WM164、WM989和451Lu细胞系进行细胞活力分析。使用CompuSyn软件分析数据，并使用Chou–Talalay方法建立组合指数（CI）值。这种药物组合产生了显著的协同细胞毒性效应，其组合指数CI<1。所描述的数据是3个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。F.评估PET-16单独或联合PLX4720（在小鼠体内）对黑色素瘤异种移植的疗效的实验设计。G.从肿瘤形成开始的第8天开始的1205Lu异种移植物肿瘤的肿瘤体积分析。与单独使用PLX4720相比，联合使用PET-16和PLX47200治疗可显著降低肿瘤体积，具有统计学意义。误差条表示标准误差。H.用二甲基亚砜或指示剂量的PET-16处理72小时后，体外获得对vemurafenib耐药的亲本Yumm1.7（左面板）和WM983B（右面板）黑色素瘤细胞及其亚系的细胞生存能力分析。所示数据是3个独立实验的平均结果。误差线表示标准偏差。
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    1. Daugaard M，Rohde M，Jaattela M。热休克蛋白70家族：具有重叠和不同功能的高度同源蛋白质。FEBS信函。2007;581(19):3702–10.-公共医学
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