跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2016年3月1日；14(8):1829-40.
doi:10.1016/j.celrep.2016.01.060。 Epub 2016年2月18日。

主轴组件检查点对APC/C活性基因降低的人类细胞的生存能力不是必需的

托马斯·怀尔德 1, 玛丽·索菲·尤·拉森 2, 成田武夫 1, 朱莉·斯科 2, 雅各布·尼尔森 三, Chunaram Choudhary公司 4
附属公司

主轴组件检查点对APC/C活性基因降低的人类细胞的生存能力不是必需的

托马斯·怀尔德等。 单元格代表。 。

摘要

后期增殖复合体/环体（APC/C）和纺锤体组装检查点（SAC）抑制APC/C，是有丝分裂时间和遗传物质忠实分裂的重要决定因素。已知APC/C的激活依赖于两种APC/C相互作用的E2泛素结合酶-UBE2C和UBE2S。我们表明，人类细胞中的APC/C活性是通过三种E2（即UBE2C、UBE2S和UBE2D）的组合使用来调节的。UBE2C和UBE2S单独或联合的基因缺失导致APC/C功能的差异性降低，并使细胞对UBE2D缺失敏感。APC/C活性的降低导致开关样中晚期转换的丢失，并显著地使细胞对MPS1的化学抑制和MAD2的基因消融不敏感，这两者对SAC至关重要。这些结果为APC/C活性的调节提供了见解，并证明SAC的重要性是由APC/C的力量决定的。

PubMed免责声明

数字

无
图形摘要
图1
图1
APC/C-相关E2s的遗传分析确定UBE2S在有丝分裂K11-连接泛素化（A）产生中的UBE2C-独立功能UBE2S公司-以及UBE2C公司-敲除HCT116细胞。Western blot分析显示所示细胞系中UBE2S和UBE2C水平。（B） 通过延时微分干涉对比（DIC）显微镜测量指示细胞中NEBD到后期的发病时间。每个圆代表一个单元格；开圆圈表示完成有丝分裂的细胞，红色圆圈表示在规定时间内没有退出有丝分裂。红线表示NEBD到后期发病时间的中位数，这在各个数据点的顶部注明。对于每个细胞系，至少从四个独立实验中分析了145个细胞。p值通过Mann-Whitney试验计算。（C） 用指定浓度的proTAME和NEBD处理细胞，然后用活细胞成像（DIC）测量后期开始时间，如（B）所示。从两个独立的实验中分析了至少70个细胞。中位数用红线表示，并标注在数据点上方。所示条件的p值显示在顶部（ns，p≥0.01）。（D） 所示细胞系非同步和有丝分裂富集细胞中K11-连接的多泛素链的分析。CCNB1水平表明有丝分裂细胞富集。
图2
图2
APC/C特异性E2s基因缺失揭示UBE2D在APC/C激活中的体内功能（A）四独立ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司产生细胞克隆并通过免疫印迹证实UBE2S和UBE2C的缺失。（B） NEBD至后期发作时间（Δ）UBE2S公司ΔUBE2C公司电池，如图1B所示进行分析。对于每个细胞系，从四个独立实验中分析了至少87个细胞。（C） 用指定浓度的proTAME和NEBD处理细胞，然后用活细胞成像（DIC）测量后期开始时间。从两个独立的实验中分析了至少55个细胞。红线表示NEBD到后期的中间时间，如数据点上方所示。所示条件的p值显示在顶部（ns，p≥0.01）。（D） NEBD到发病后期的时间分析如图1B所示。拍摄前24小时，WT和指示ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司用靶向小干扰RNA（siRNAs）处理细胞克隆ube2天（+）或对照（−）siRNA。对于每种情况，从三个独立的实验中分析了至少113个细胞（ns，p≥0.01）。（E） 用靶向UBE2D（+）或对照siRNA（−）的siRNAs处理细胞，并用活细胞成像（DIC）测量NEBD到发病后期的时间。从三个独立实验中分析了至少95个细胞。中位数用红线表示，中位数时间显示在数据点上方。所示条件的p值显示在顶部（ns，p≥0.01）。（F） 所示细胞系的CCNB1降解曲线。CCNB1的一个等位基因被Venus标记，并通过活细胞成像分析CCNB1-Venus的降解。时间=0设置为CCNB1退化开始前的两帧，这被定义为CCNB1-Venus强度下降>4%。曲线描述了分析细胞的平均CCNB1-Venus荧光强度（从时间=0到后期开始后的五个时间帧），单侧误差条显示SD。（G）CCNB1降解率是根据（F）中所示的实验计算的。确定了两个时间点之间CCNB1-Venus强度最大差异（归一化为NEBD）周围的最佳线性拟合，并绘制了相应的斜率。平均值标注在数据点顶部，并用红线表示，SDs显示为垂直线。通过t检验计算p值（ns，p≥0.01）。另请参见图S1–S3。
图3
图3
UBE2S和UBE2C联合呈现SAC对细胞活力的重要性（A）NEBD，通过延时显微镜（DIC）测量诺康唑治疗后指示细胞系的后期开始时间（30 ng/ml）。每个圆圈代表单个细胞（红色圆圈表示在规定时间内没有退出有丝分裂的细胞）。从两个独立的实验中分析了至少61个细胞。中位数用红线表示，并标注在数据点上方。所示比较的p值通过Mann-Whitney检验计算（ns，p≥0.01）。（B） 在存在或不存在0.5μM逆转的情况下，对所示细胞系进行生长分析。使用基于发光的检测ATP水平的分析在指定时间评估细胞增殖。基于每个时间点至少六个测量值，为每个细胞系和条件绘制局部回归曲线。（C） 的生成UBE2S公司,UBE2C公司、和摩洛哥迪拉姆2三敲除细胞。免疫印迹证实亲代ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司#3和三敲除克隆。（D） 有丝分裂声型的比较摩洛哥迪拉姆2-删除ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司#3个具有WT细胞的细胞，其中摩洛哥迪拉姆2被RNAi击倒。通过活细胞成像监测瞬时转染RFP标记组蛋白H2B的细胞，并将其分为代表正常和异常有丝分裂表型的类别。从三个独立实验中分析了至少27个细胞。（E） 直方图描述了指定细胞中的DNA含量（2N、2-4N和>4N；N近似于单倍体基因组），这些细胞在指定的时间（hr）内培养有或没有逆转（0.5μM）。嵌体显示了在特定细胞和条件下具有指示DNA含量的细胞的百分比；数值显示了三个独立实验的平均值±标准偏差。DNA含量通过碘化丙啶染色和流式细胞仪分析。对于每个实验，每个条件下至少分析9000个细胞。直方图显示了其中一个实验的代表性数据。转速，反转。另请参见图S4。
图4
图4
Δ中SAC抑制分析UBE2S公司ΔUBE2C公司和TP53型-敲除细胞（A）Δ的生长分析UBE2S公司ΔUBE2C公司单元格和TP53型-存在或不存在0.5μM逆转的敲除细胞。使用基于发光的检测ATP水平的分析在指定时间评估细胞增殖。基于每个时间点至少六个测量值，为每个细胞系和条件绘制局部回归曲线。（B） 抑制MPS1导致HCT116 WT和Δ的多倍体TP53型单元格，但不在Δ中UBE2S公司ΔUBE2C公司细胞。细胞用逆转剂处理4天，培养2天后更换培养基。细胞DNA用Hoechst染色，并用宽视野显微镜成像。比例尺代表20μm。（C） 击倒摩洛哥迪拉姆2加速有丝分裂进程。瞬时转染细胞摩洛哥迪拉姆2用延时显微镜监测siRNA和RFP标记组蛋白H2B。对所示细胞系的NEBD后期发病进行分析；每个圆圈代表一个单元格。p值通过Mann-Whitney试验计算。（D） WT有丝分裂的比较，ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司，和ΔTP53型单元格位于摩洛哥迪拉姆2击倒。根据（C）中所示的实验分析有丝分裂细胞中中期板的形成。请注意摩洛哥迪拉姆2单位WT和ΔTP53型细胞导致中期板形成的严重问题。
图5
图5
抑制SAC对APC/C活性受损的细胞产生有益影响（A）WT中MPS1水平的Western blot分析和指示的ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司显示了细胞克隆。（B） NEBD至后期发病时间（Δ）UBE2S公司ΔUBE2C公司#4在有或无诺卡唑的情况下，以及在有诺卡唑存在的情况下TFP-MPS1转染。从三个独立的实验中分析了至少30个细胞。中位数用红线表示，并标注在数据点上方。所示条件的p值显示在顶部。（C） Δ生成示意图UBE2S公司ΔUBE2C公司-R电池。UBE2C公司在Δ中删除UBE2S公司存在逆转的细胞。（D） Western blot分析WT中UBE2S和UBE2C水平以及指示的ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司-图中显示了R细胞克隆。（E） 在存在或不存在0.5μM逆转的情况下，对所示细胞系进行生长分析。使用基于发光度的测定ATP水平的分析评估指示细胞和时间的细胞增殖。基于每个时间点至少六个测量值，为每个细胞系和条件绘制局部回归曲线。（F） 用时间推移显微镜（DIC）分析NEBD到发病后期的时间。每个圆圈代表单个细胞（红色圆圈表示在规定时间内没有退出有丝分裂的细胞）。WT细胞在以下条件下培养：对照，无逆转；rev，试验开始时添加的逆转；冲洗后，细胞与reversine培养24小时，并在开始拍摄前取出reversine。ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司-R细胞在以下条件下培养：rev，细胞在reversine中连续培养；洗脱后第天，从在reversine中持续培养的细胞中洗脱reversine，并在去除reversine后的指定天数后进行涂膜。NEBD到后期发病时间的中位数用红线表示，并在数据点上方注明。从每个细胞系和条件中至少分析41个细胞。通过Mann-Whitney试验计算p值（ns，p≥0.01）。（G） NEBD与后期发病时间的关系，如（F）所述进行分析。在拍摄前24小时，用siRNAs靶向细胞摩洛哥迪拉姆2（+）或对照（−）siRNA.ΔUBE2S公司ΔUBE2C公司-R细胞用0.5μM reversine（rev）连续培养，或在拍摄前（冲洗）或拍摄前3天（rev去除后3天）去除reversine。从两个实验中分析了至少81个细胞（ns，p≥0.01）。另请参见图S5。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Abrieu A.、Magnaghi-Jaulin L.、Kahana J.A.、Peter M.、Castro A.、Vigneron S.、Lorca T.、Cleveland D.W.、LabbéJ.C.Mps1是脊椎动物有丝分裂检查点所必需的动粒相关激酶。单元格。2001;106:83–93.-公共医学
    1. Bastian H.、Topper L.M.、Gorbsky G.L.、Ruderman J.V.有丝分裂靶蛋白的细胞周期调节蛋白水解。分子生物学。单元格。1999;10:3927–3941.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ben Eliezer I.，Pomerantz Y.，Galiani D.，Nevo N.，Dekel N.Ube2C和Ube2S的适当表达控制第一次减数分裂的进展。FASEB J.2015；29:4670–4681.-公共医学
    1. Berdougo E.、Terret M.E.、Jallepalli P.V.通过人类体细胞中的基因靶向对有丝分裂调节器进行功能解剖。方法分子生物学。2009;545:21–37.-公共医学
    1. Buffin E.、Emre D.、Karess R.E.没有纺锤检查点的苍蝇。自然细胞生物学。2007;9:565–572。-公共医学

出版物类型

MeSH术语