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.2016年4月1日；8(4):328-45.
doi:10.15252/emmm.201505846。

反义寡核苷酸对阿尔茨海默病小鼠ApoER2剪接的治疗作用

安东尼·辛里奇 1, 弗朗辛·乔德尔卡 1, 詹妮弗·L·张 1, 丹妮拉·布鲁特曼 2, 安吉拉·布鲁诺 3, 克拉克·布里格斯 3, 布莱恩·D·詹姆斯 4, 格蕾丝·斯图兹曼 3, 大卫·A·贝内特 4, 史蒂文·米勒 5, 弗兰克·里戈 6, 罗伯特·马尔 3, 米歇尔·黑斯廷斯 7
附属机构

反义寡核苷酸对阿尔茨海默病小鼠ApoER2剪接的治疗作用

安东尼·辛里奇等。 EMBO分子医学. .

摘要

载脂蛋白E受体2（ApoER2）是一种参与长期增强、学习和记忆的载脂蛋白E受体。鉴于其在认知中的作用及其与阿尔茨海默病（AD）风险基因apoE、ApoER2的关联性，人们认为apoE、ApoER2与AD有关，但受体在疾病中的作用尚不明确。ApoER2信号需要由选择性剪接外显子19编码的氨基酸。在这里，我们报告了AD患者死后脑组织和AD转基因小鼠模型中ApoER2外显子19剪接的平衡被解除。为了测试解除调控的ApoER1剪接在AD中的作用，我们设计了一种反义寡核苷酸（ASO），增加外显子19-剪接。单剂量ASO治疗AD小鼠可纠正长达6个月的ApoER2剪接，并改善突触功能和学习记忆。这些结果揭示了ApoER2亚型表达与AD之间的关联，并为ASO作为一种治疗方法的实用性提供了临床前证据，通过改善ApoER2exon 19剪接来缓解阿尔茨海默病症状。

关键词：阿尔茨海默病；反义寡核苷酸；载脂蛋白ER2；拼接；治疗学。

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数字

图1
图1。阿波急诊室2外显子19在人类和小鼠中的包含率较低AD公司大脑与非大脑相比AD公司样品

  1. Apo示意图急诊室2通过配体结合进行表达和信号传递（例如Reelin、ApoE）。阿波急诊室2外显子19的选择性剪接产生两个载脂蛋白急诊室2种具有不同功能的蛋白质亚型。而载脂蛋白的两种亚型急诊室2（+ex19和Δex19）可以结合配体，配体是载脂蛋白的蛋白质结构域急诊室外显子19编码的2与屏蔽门95调节载脂蛋白的结合急诊室2和NMDAR公司Reelin装订后的复杂情况。这种信号通过以下途径导致钙内流NMDAR公司s与长时程增强的诱导(长期有形资产).

  2. RT公司–聚合酶链反应分析核糖核酸来自颞叶中期尸检脑切片NCI公司，MCI公司，或AD公司学科。显示了具有代表性的结果凝胶。

  3. 定量RT公司–聚合酶链反应从死后脑组织中分析的所有样本的产物（平均值±标准偏差）。使用单向方差分析（单向方差分析)与Tukey后测试一起确定P（P）‐价值。分析的样品数量(n个)显示。

  4. RT公司–聚合酶链反应分析核糖核酸1至2个月龄和3至7个月龄非转基因小鼠的海马(重量)或TgCRND公司8个(AD公司)老鼠。

  5. Tg外显子19内含子相对比率的量化CRND公司8个(AD公司)和重量小鼠（平均值±s.e.m.；单向方差分析与Tukey测试）。分析的样品数量(n个)显示。

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图2
图2。反义寡核苷酸改善人类阿波急诊室2外显子19内含子

  1. 的基因结构阿波急诊室2外显子18-20及其结果核糖核酸和蛋白质产品。方框是外显子，线条代表内含子。对角线表示拼接。

  2. 顶部，示意图ASO公司下面测试了它们的互补性位置阿波急诊室2.底部，RT公司–聚合酶链反应属于核糖核酸从转染有ASO公司最终浓度为80 nM。核糖核酸拼接的表单会被标记。包含率的量化如下图所示，计算为：包含率（%）=[包含第19外显子/（包含第19外显子+跳过第19外显子）]×100。

  3. 顺序和Apo公司急诊室2最活跃的目标区域ASO公司s来自（B）。外显序列和内含序列分别用大写字母和小写字母表示。人和小鼠之间的保守核苷酸阿波急诊室2以黑色显示，非保守核苷酸以红色显示。剪接因子的预测保守结合位点标记为内含子剪接沉默子(国际空间站1和国际空间站2） 。

  4. 顶部，RT公司–聚合酶链反应分析阿波急诊室2缺失HeLa细胞外显子19剪接SRSF公司1使用SRSF公司1特定si核糖核酸控制是非特定si核糖核酸.底部，免疫印迹分析SRSF公司1份来自HeLa裂解物SRSF公司1.将β-actin作为对照。

  5. （D）外显子19剪接的量化。误差条显示s.e.m。P（P）使用Student的双尾t吨‐测试。

  6. 顶部，RT公司–聚合酶链反应原代小鼠肾癌细胞株第19外显子剪接分析SRSF公司1由核糖核酸i.控制为非特定si核糖核酸.底部，免疫印迹分析SRSF公司1份来自HeLa裂解物SRSF公司1.将β-actin作为对照。

  7. （E）外显子19剪接的量化。误差条显示s.e.m。P（P）使用Student的双尾法计算值t吨测试。

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图3
图3。反义寡核苷酸改善小鼠阿波急诊室2外显子19内含子

  1. 顶部，ASO公司映射到鼠标上的阿波急诊室2外显子19基因区。底部，RT公司–聚合酶链反应属于核糖核酸从转染不同基因的小鼠细胞中分离ASO公司s.凝胶图像下方显示了外显子19内含物百分比的量化。

  2. ASO公司以剂量反应的方式改善外显子19的内含子。RT公司–聚合酶链反应分析核糖核酸来自转染剂量增加的小鼠细胞ASO公司凝胶图像下方显示了外显子19的包含百分比。半最大有效浓度(欧盟委员会 50)使用GraphPad Prism 6.0版（GraphPad-Software，圣地亚哥，加利福尼亚州)用归一化响应和可变斜率的非线性回归对数据进行拟合。

  3. 顺序和阿波急诊室2最活跃小鼠的目标区域ASO公司s来自（A）。外显序列和内含序列分别用大写字母和小写字母表示。

  4. RT公司–聚合酶链反应分析核糖核酸从成年小鼠海马分离智能网联汽车注入指示的ASO公司s.C指非特定控制ASO公司.

  5. 载脂蛋白定量急诊室第2外显子19包含在（D）中（平均值±s.e.m.，单向方差分析Bonferroni多重比较试验）。

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图EV1
图EV1。WT和AD小鼠重量和开放场分析

  1. 3月龄WT和AD小鼠的体重。AD组之间的体重没有显著差异（男性：KW=0.028，P（P） = 0.986; 雌性：KW=1.714，P（P）=0.42）或WT（雄性：KW=3.22，P（P） = 0.20; 雌性：KW=2.53，P（P）=0.28）组。AD组与WT组有显著差异（男性：KW=44.48，P（P） < 0.0001; 女性：KW=42.86，P（P） < 0.0001). 分析的样品数量(n个)显示。

  2. 分别用GFAP和Aif1 qRT–PCR检测小胶质细胞活化和星形胶质细胞增生。ASO治疗4个月后，从小鼠皮层中分离出用于分析的RNA。学生的t吨对结果进行了双尾测试，n个=每组3个，平均值±标准误差。

  3. 还进行了GFAP（星形胶质细胞标记物）的免疫印迹分析，以进一步评估星形胶质细胞增多症。β-actin被用作负荷控制。右侧显示了蛋白质的定量（平均值±标准偏差。，P（P）>0.05，学生的t吨‐测试）。

  4. 露天分析。小鼠的整体活动水平在一个开放场室中进行评估。在测试的10分钟时间内，两组之间的总行驶距离没有显著差异（Kruskal–Wallis测试，男性：KW=3.72，P（P） = 0.59; 女性：KW=10.65，P（P）=0.06）。分析的样品数量(n个)显示。

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图EV2
图EV2。ASO‐21增加载脂蛋白ER2治疗后1周和6个月时外显子19的内含物

  1. ASO‐C治疗的P8 TgCRND8（AD）小鼠海马分离RNA的RT-PCR分析(n个=5）或ASO‐21(n个=4）通过在P2注射ICV。定量显示在凝胶图像的右侧（平均值±标准偏差，学生的t吨‐测试）。

  2. 对ASO‐C治疗的6个月龄WT和AD小鼠海马分离的RNA进行RT-PCR分析(n个=6）或ASO‐21(n个=11）通过在P1或P2处注射ICV。定量显示在凝胶图像的右侧（平均值±标准偏差，学生的t吨‐测试）。

  3. 对用ASO‐C治疗的4个月龄AD小鼠皮层分离的RNA进行RT-PCR分析(n个=2）或ASO‐21(n个=4）通过在P1或P2处注射ICV。定量显示在凝胶图像的右侧（平均值±标准偏差，学生的t吨‐测试）。

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图4
图4。ASO公司‐21改善Apo急诊室2外显子19内含物体内治疗后4个月

  1. RT公司–聚合酶链反应分析阿波急诊室2外显子19剪接核糖核酸从4个月大的海马分离AD公司和重量用ASO公司‐21或ASO公司P1‐2的‐C。

  2. 外显子19剪接的定量（平均值±标准差；Kruskal–Wallis试验和Dunn多重比较试验）。分析的样品数量(n个)显示。

  3. 含载脂蛋白第19外显子的免疫印迹急诊室2（顶部）和总载脂蛋白急诊室2（底部）。β-actin被用作负荷控制。

  4. 载脂蛋白的定量急诊室2种蛋白质亚型如（C）所示（平均值±标准偏差，学生t吨‐测试）。分析的样品数量(n个)显示。

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图5
图5。ASO公司‐21减少海马体基础突触传递强度的缺陷AD公司老鼠

  1. 输入-输出曲线显示海马加利福尼亚州1场兴奋性突触后电位(兴奋性突触后电位)作为传递到Schaffer侧支传入纤维的刺激强度函数的响应幅度。双向重复测量方差分析显示出显著的治疗效果(F类 (2,119) = 31.62,P（P）<0.0001），Bonferroni多重比较测试显示ASO公司‐C‐处理AD公司和年龄匹配ASO公司‐C‐处理重量(*P（P）<0.05）。来自的回复ASO公司‐21‐处理AD公司小鼠与ASO公司经C处理重量或AD公司老鼠。

  2. 典型的配对脉冲促进(购买力平价)响应来自ASO公司‐C‐处理重量（顶部），ASO公司‐C‐处理AD公司（中间），和ASO公司‐21‐处理AD公司（底部）鼠标显示在左侧。比例尺=0.2 mV x 10 ms适用于所有记录道。条形图（右侧）总结了成对脉冲比率。购买力平价在以下方面没有显著差异AD公司与相比重量样品，也没有受到ASO公司‐21治疗。

  3. 长期有形资产之后未受影响ASO公司‐21种治疗方法和类似方法AD公司与相比重量老鼠。组合来自多个切片的数据，单独测量兴奋性突触后电位上升斜率标准化为破伤风刺激前0–10分钟的平均基线值（箭头）。将标准化值绘制为时间的函数ASO公司‐C‐处理重量（灰色，左侧），ASO公司‐C‐处理AD公司（红色，中间），和ASO公司‐21‐处理AD公司老鼠（蓝色，右侧）。插图中显示了强直刺激前和50‐60分钟后采集的典型记录道（所有记录道的刻度条=0.2 mV x 10 ms）。

  4. 图表摘要长期有形资产结果作为平均值的比率兴奋性突触后电位破伤风刺激后50～60min测得的上升斜率除以破伤风前0～10min测得的升高斜率。各组之间没有显著差异。数据信息：所有数据均显示为平均值±标准偏差，来自同一海马脑片(n个=4、3和4中的6个切片重量/ASO公司-C，AD公司/ASO公司‐C和AD公司/ASO公司每组21只动物）。

图EV3
图EV3。Aβ肽丰度不受ASO‐21治疗对AD小鼠的影响
图中显示了用ASO‐C或ASO-21治疗的小鼠大脑皮层中Aβ42的丰度（平均值±标准偏差，Student’st吨‐试验）。分析的样品数量(n个)显示。
图6
图6。反义寡核苷酸改善小鼠模型的学习和记忆能力AD公司
  1. A类

    第3天最后四次试验的典型水迷宫路径痕迹。试验1显示为红色，试验2显示为绿色，试验3显示为蓝色，试验4显示为黑色。

  2. B

    莫里斯水迷宫(MWM公司)雄性（左）和雌性（右）小鼠的捕获性能分析，表示为小鼠每天找到水下平台的平均距离（cm）（平均值±标准偏差）符号表示同一基因型内的统计显著差异(*AD ASO公司‐C与。AD ASO公司‐21和# WT ASO公司‐C与。WT ASO公司‐21）或相同治疗组之间(Δ AD ASO公司‐C与。WT ASO公司‐C和^AD ASO公司‐21与。WT ASO公司‐21）（双向重复测量方差分析采用Tukey多重比较试验**P（P）<0.01，^ P（P） < 0.05,ΔΔΔΔ P（P）<0.0001）。有关统计结果，请参阅源数据。

  3. C类

    莫里斯水迷宫分析综合距离（张等（曲线下面积，AUC公司)适用于男性（左）和女性（右）重量和AD公司对照组小鼠ASO公司(ASO公司‐C）或ASO公司‐21（平均值±标准误差；单向方差分析，Tukey后测试）。分析的样品数量(n个)显示。

  4. D、 E类

    第3天的绩效相关性分析MWM公司第19外显子在所有小鼠组（D）之间跳跃AD公司用ASO公司‐C或ASO公司‐21（E）。显示雄性和雌性小鼠。皮尔逊相关系数(第页)、协方差（σ）和双尾P（P）值如图所示。

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图EV4
图EV4。Morris水迷宫数据的曲线下面积分析
Morris水迷宫分析整合了服用对照ASO（左）或ASO‐21（右）的雄性和雌性AD（上）和WT（下）小鼠的曲线下距离面积（AUC）（平均值±s.e.m.；学生t吨‐测试）。小鼠与图6中分析的小鼠相同。
图EV5
图EV5。莫里斯水迷宫游泳速度和探针试验分析

  1. 莫里斯水迷宫任务中小鼠游泳速度的定量。这些数字代表每只小鼠在测试4天中的平均值（平均值±标准偏差）。所有男性的游泳速度没有显著差异（Kruskal–Wallis测试，KW=5.77，P（P）=0.12）或女性（Kruskal–Wallis，KW=7.846，P（P）=0.05）组采用Dunn多重比较试验。

  2. 探针试验结果（平均值±标准误差。；P（P）=0.4256（男性），P（P）=0.7576（女性），单向方差分析）。

  3. Morris水迷宫（MWM）分析雄性（左）和雌性（右）小鼠的捕获性能，以小鼠在每个训练日的第一次试验中找到水下平台的平均距离（cm）表示（平均值±s.e.m.）符号表示同一基因型内具有统计显著性差异（*AD ASO‐C vs。AD ASO‐21和#WT ASO‐C vs.WT ASO-21）或相同治疗组之间(ΔAD ASO-C与WT ASO-C以及AD ASO-21与WT AS O-21）（采用Tukey多重比较测试的双向重复测量方差分析*P（P） < 0.05,Δ P（P） < 0.05,ΔΔ P（P） < 0.01).

图EV6
图EV6。ASO‐21不影响基因组靶点的剪接或表达

  1. ASO‐21在小鼠基因组中有一个与其他三个位点不匹配的核苷酸。显示了与这些潜在的非靶点结合位点相关的基因。图中显示了该位点的位置、内含子长度、相对于附近地标的位置、特定错配以及ASO‐21和非目标位点之间假定双链中的相邻碱基对。

  2. 如图4所示，对用ASO‐C或ASO‐）21治疗的AD小鼠皮层分离的RNA进行RT-PCR分析。扩增预计受ASO‐21结合影响的转录物的特定区域，并在2%琼脂糖凝胶上分离产物。未观察到异常剪接或选择性剪接模式的变化。

  3. 用ASO-C或ASO-21治疗的AD小鼠皮层MetAP2蛋白的免疫印迹分析，如图4所示。ASO‐21可能在MetAP2起始密码子上游形成假定的双链，可能影响表达。

  4. 描述（C）中所述MetAP2蛋白表达定量的图表。条形代表平均值±标准误差。

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中的注释

  • 阿尔茨海默病的剪接疗法。
    Wasser CR，赫兹J。 Wasser CR等人。 EMBO分子医学。2016年4月1日；8(4):308-10. doi:10.15252/emmm.20150607。 EMBO Mol Med.2016年。 PMID：26902203 免费PMC文章。

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