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.2015年12月22日；6(41):43310-25.
doi:10.18632/目标6383。

蛋白酶体抑制介导宫颈癌细胞p53活化和6-姜酚的抗癌活性

纳姆拉塔·拉斯托吉 1, 西瓦利·达加尔 2, 沙林德拉·库马尔·辛格 3, 科尼卡·波瓦尔 1, 维卡斯·库马尔·斯利瓦斯塔瓦 2, Rakesh Maurya公司 4, M L B巴特 2, 杜尔加·普拉萨德·米什拉 1
附属公司

蛋白酶体抑制介导宫颈癌细胞p53活化和6-姜酚的抗癌活性

纳姆拉塔·拉斯托吉等。 Oncotarget公司. .

摘要

已知表达E6和E7癌蛋白的人乳头瘤病毒（HPV）通过蛋白酶体降解使宫颈癌中的抑癌基因p53失活。因此，使用小分子抑制蛋白酶体功能和诱导p53再激活是诱导宫颈癌细胞凋亡的一种有前途的策略。生姜（Zingiber officinale Roscoe）刺激性提取物中存在的多酚烷酮，6-姜甾醇（6G），对多种癌症显示出强大的抗肿瘤和促凋亡活性。本研究探讨了6G在体内外对人宫颈癌细胞作用的分子机制。6G能有效抑制HPV阳性宫颈癌细胞的增殖。6G被发现：（i）抑制蛋白酶体的糜蛋白酶活性，（ii）诱导p53活化，（iii）增加p21水平，（iv）诱导DNA损伤和G2/M细胞周期阻滞，（v）改变p53相关凋亡标记物的表达水平，如裂解caspase-3和PARP，以及（vi）增强顺铂的细胞毒性。6G治疗可显著降低体内HeLa异种移植瘤细胞的肿瘤体积、肿瘤重量、蛋白酶体抑制和p53蓄积。6G治疗没有毒性作用，因为它不会影响体重、血液学和成骨参数。总之，我们的数据强调了6G在宫颈癌管理和治疗中的治疗和化学增敏作用。

关键词：6-姜酚；染色体切片；人乳头瘤病毒；宫颈癌；p53活化；蛋白酶体。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。6G抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖
答：。（6）-姜辣素的三维结构。B。用指示浓度的6G处理HeLa、CaSki和SiHa细胞24、48和72小时，并使用MTT进行细胞活力测定。剂量反应曲线表明，与正常对照组相比，细胞活力显著降低(*第页< 0.05).C、。用相差显微镜检测6G（50μM）处理后细胞的形态变化。D。用6G（50μM）处理HeLa、CaSki和SiHa细胞24小时，并进行Annexin-V-FITC/碘化丙啶染色，以测定细胞凋亡率。代表性图片显示每个象限中凋亡细胞的百分比。数据以平均值±标准差表示，代表三个独立实验。
图2
图2。6G诱导宫颈癌细胞p53活化
答：。通过实时PCR表达分析分析6G（50μM）对HPV癌基因（E6和E7）和p21表达的影响，其中18S RNA用于标准化(*第页< 0.05).B。与未经处理的对照组相比，用6G处理18小时的HeLa和CaSki细胞，通过p53反式激活试验测量p53含量的增加。(*第页<0.05）数据表示为平均值±SD，代表三个独立实验。C、。用免疫荧光和共聚焦显微镜观察6G（50μM）处理18h后HeLa和CaSki细胞中p53（红色）和p21（绿色）的表达和定位。图像是在63倍放大的条件下拍摄的，是三个独立实验的代表性图像。D。western blot检测经6G（25和50μM）处理的HeLa和CaSki细胞中p53和p21蛋白的高表达。硼替佐米（10nM）处理的细胞用于阳性对照，β-肌动蛋白用作负荷对照。给出了三个独立实验的代表性数据。
图3
图3。6G抑制HPV阳性宫颈癌细胞蛋白酶体活性
答：。6G分子对接模拟显示其在蛋白酶体亚单位中的潜在结合位点。（左面板）6G（蓝色）、硼替佐米（黄色）和乳酸菌素（粉红色）的三维结构比较。（中面板）蛋白酶体20S核心单元β-5催化亚基的带状结构。6G、硼替佐米和乳糜蛋白酶结合囊中负责糜蛋白酶活性的β-5亚基（用黄色圈起来）的相似性显示出来（右图）。6G与β-5亚基的相互作用残基。B。用蛋白酶体活性测定试剂盒测定分离蛋白酶体的蛋白酶体活性。6G（25、50和75μM）处理24小时后，手动分离HeLa和CaSki细胞的蛋白酶体。用硼替佐米（10nM）治疗阳性对照。数据为平均值±SD，其中**第页<0.01和***第页< 0.001. 给出的结果是三个独立实验的柱状图。C、。用6G（25、50和75μM）和硼替佐米（10 nM）处理细胞后，对细胞进行裂解并进行蛋白质印迹以监测泛素化蛋白。β-actin作为负荷控制。D。通过将6G处理的（50μM）HeLa和CaSki细胞与特定底物孵育，并在1h后测量吸光度，评估培养细胞中的蛋白酶体活性。与对照细胞相比，经6G处理的培养细胞的糜蛋白酶活性显著降低。(**第页< 0.01). 三个独立实验的代表性数据表示为Mean±SD。
图4
图4。6G诱导的活性氧和DNA损伤增强宫颈癌细胞中p53依赖性G2/M细胞周期阻滞
答：。采用CM-H2DCFDA染色荧光法测定细胞内ROS生成。收集细胞，清洗并在黑暗中染色30分钟。用6G处理6小时后，以慢动力学荧光法测量荧光强度。与对照组和NAC（4mM）和PEG过氧化氢酶（200IU）预处理组相比，6G处理组的ROS水平显著增加(*第页< 0.05). 三个独立实验的数据表示为平均值±SD。B。通过免疫荧光和western blotting检测HeLa和CaSki细胞中细胞内p-H2AX（绿色）水平，以测量细胞DNA损伤。用NAC或不加NAC预处理细胞1h，然后用6G（50μM）处理细胞12h。DAPI作为细胞核（蓝色）的免疫荧光反染，β-actin作为western blot的负荷对照。给出了三个独立实验的代表性图像C、。用流式细胞仪测定6G对细胞周期相分布的影响。直方图峰值和条形图结果表明，与对照组相比，G2/M期细胞百分比增加(*第页< 0.05)D。6G处理后G2/M细胞周期相变相关蛋白的Western blot分析。E.公司。Annexin-V-FITC/PI染色检测到，用p53抑制剂Piffithrin-α（10μM）预处理细胞可降低HeLa和CaSki细胞的凋亡百分比。(*第页< 0.05).F、。和G.公司。NAC（4 mM）预处理细胞可显著降低凋亡率F、。和p53反式激活G.公司。在HeLa和CaSki细胞中*第页<0.05。H。对HeLa和CaSki处理细胞中裂解的Caspase-3和PARP进行Western blot分析，如图所示。β-actin作为负荷控制。三个独立实验的代表性数据以平均值±标准差表示。
图5
图5。6G增强顺铂诱导的HeLa细胞毒性
答：。用6G（50μM）和顺铂（2.5μM）单独或联合处理HeLa细胞24小时，并分析凋亡细胞百分比。结果表明，与对照组相比，凋亡早期和晚期的凋亡细胞均显著增加*第页<0.05。B。用6G和顺铂联合处理的细胞中CM-H2DCFDA平均荧光测定ROS生成的增加。C、。荧光显微镜和HeLa细胞的western印迹显示6G和顺铂联合处理后细胞中p-H2AX的免疫荧光。D。6G和/或顺铂处理的细胞固定，PI染色，流式细胞仪分析细胞在每个周期阶段的分布。条形图表明，与单独治疗组和对照组相比，联合治疗组的细胞积累增加*第页< 0.05. 三个独立实验的代表性数据表示为平均值±SD。
图6
图6。在HeLa异种移植模型中6G抑制肿瘤生长
答：。用或不用6G（2.5mg/Kg bw和5.0mg/Kg bw）和乳酸菌素（0.5mg/Kg bw）治疗的异种移植小鼠的肿瘤体积。B。实验小鼠的平均肿瘤重量*第页与健康对照组相比<0.05。C、。指定治疗组的异种移植小鼠的体重。D。通过western blot分析确定异种移植组织中泛素化蛋白积累的增加。E.公司。在指定的组内评估异种移植瘤组织中的糜蛋白酶（CT）样活性。F、。异种移植小鼠裂解肿瘤组织中p53靶蛋白Bax、GADD45、Noxa、PUMA和p21的Western blots。G.公司。异种移植瘤细胞中丙二醛的水平H。从具有指定治疗组的异种移植小鼠的血浆中测量ALT水平。三个独立实验的代表性数据表示为平均值±SD。一、。HPV感染宫颈癌细胞中6G治疗引发的分子事件示意图。
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