The decrease in histone methyltransferase EZH2 in response to fluid shear stress alters endothelial gene expression and promotes quiescence

doi:10.1007/s10456-015-9485-2

.2016年1月；19(1):9-24.

doi:10.1007/s10456-015-9485-2。 Epub 2015年9月28日。

组蛋白甲基转移酶EZH2在流体剪切应力作用下的减少改变了内皮基因的表达并促进了平静

莫妮卡·马莱斯泽夫斯卡^1 2, Byambasuren Vanchin公司^三, 马丁·C·哈姆森^三, 吉多·克伦宁⁴

附属公司

¹心血管再生医学研究小组，病理学和医学生物学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ，Groningen，荷兰。m.maleszewska@gmail.com。
²马克斯·普朗克衰老生物学研究所染色质与衰老研究小组，德国科隆Joseph-Stelzmann-Str.9b，50931。m.maleszewska@gmail.com。
^三心血管再生医学研究小组，病理学和医学生物学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ，Groningen，荷兰。
⁴心血管再生医学研究小组，病理学和医学生物学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ，Groningen，荷兰。g.krening@umcg.nl。

PMID： 26416763
PMCID公司： PMC4700080型
内政部： 2007年10月10日/10456-015-9485-2

组蛋白甲基转移酶EZH2在流体剪切应力作用下的减少改变了内皮基因的表达并促进了平静

莫妮卡·马莱斯泽夫斯卡等。血管生成. 2016年1月.

.2016年1月；19(1):9-24.

doi:10.1007/s10456-015-9485-2。 Epub 2015年9月28日。

作者

莫妮卡·马莱斯泽夫斯卡^1 2, Byambasuren Vanchin公司^三, 马丁·C·哈姆森^三, 吉多·克伦宁⁴

附属公司

¹心血管再生医学研究小组，病理学和医学生物学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ，Groningen，荷兰。m.maleszewska@gmail.com。
²马克斯·普朗克衰老生物学研究所染色质与衰老研究小组，德国科隆Joseph-Stelzmann-Str.9b，50931。m.maleszewska@gmail.com。
^三心血管再生医学研究小组，病理学和医学生物学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ，Groningen，荷兰。
⁴格罗宁根大学格罗宁根医学中心病理学和医学生物学系心血管再生医学研究小组，荷兰格罗宁根，Hanzeplein 1（EA11），9713 GZ。g.krening@umcg.nl。

PMID： 26416763
PMCID公司： PMC4700080型
内政部： 2007年10月10日/10456-015-9485-2

摘要

高均匀流体剪切应力（FSS）可保护动脉粥样硬化，并通过激活下游介质（如MAPK7（Erk5））保持内皮细胞表型和功能。内皮细胞通过机械传导对FSS作出反应。然而，如何在表观遗传水平上整合和解决产生的信号仍不清楚。我们假设Polycomb甲基转移酶EZH2参与人内皮细胞FSS的作用。我们发现FSS降低Polycomb甲基转移酶EZH2的表达。尽管MAPK7同时激活，但MAPK7通路并不直接影响EZH2的转录。然而有趣的是，EZH2的敲除激活了内皮细胞中的保护性MAPK7信号，即使在没有FSS的情况下也是如此。为了了解FSS降低EZH2表达对内皮转录组的影响，我们进行了RNA-seq和差异基因表达分析。我们确定了依赖EZH2和FSS的候选基因组。其中，基因本体过度表达分析显示细胞周期相关基因高度富集，表明增殖发生变化。事实上，EZH2的缺失强烈抑制了内皮细胞的增殖，表明细胞周期停滞。CCNA表达的同时降低表明内皮细胞转变为静止表型。进一步的生物信息学分析表明，TXNIP可能是EZH2与细胞周期相关基因网络之间的中介体。EZH2水平的降低增强了动脉粥样硬化保护性MAPK7信号传导的激活。FSS下EZH2的减少介导了细胞周期相关基因网络表达的减少，从而使细胞进入静止状态。因此，EZH2对FSS对内皮的保护作用很重要。

关键词：染色质；内皮细胞；玉米醇同系物-2（EZH2）增强子；流体剪切应力（FSS）；机械传输。

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数字

图1
FSS导致EZH2基因和蛋白表达降低。HUVEC在20达因/厘米的条件下培养72小时²FSS。一典型的西方吸墨纸图像。b条FSS下EZH2的基因表达，n个 = 4, **对 < 0.01,t吨测试和**c（c）**通过western blotting数据的密度测定获得EZH2在FSS下的蛋白表达，n个 = 3, **对 < 0.01,t吨测试

图2
EZH2的蛋白表达随着MAPK7的激活而降低。组成活性MEK5互斥蛋白（MEK5D）在HUVEC中表达。一典型的西方吸墨纸图像。b条EZH2在表达MEK5D的细胞中的蛋白表达，通过western blotting数据的密度测定获得，n个 = 6, *对 < 0.05,t吨测试和**c（c）**EZH2在表达MEK5D的细胞中的基因表达，n个 = 4

图3
EZH2水平决定MAPK7的活化能力。一EZH2缺失细胞中MAPK7的基因表达。通过慢病毒载体在HUVEC中表达抗EZH2 shRNA 7天。用加扰shRNA作为对照，n个=3。b条western blotting的代表性图像显示，在HUVEC中EZH2敲除7天后，静态条件下MAPK7的激活增强。**c（c）**密度测定结果显示，在静态条件下，EZH2被敲除后，MAPK7的活化增强，该结果来源于western印迹数据，归一化为β-肌动蛋白（ACTB），n个 = 3, **对 < 0.01,t吨测试。d日代表性的蛋白质印迹图像，显示在静止和FSS暴露的培养物中，与对照相比，EZH2耗尽的细胞中MAPK7的激活增强。虚线指示图像被人为连接的位置：它们是同一个膜的一部分（一个图像），移动只是为了按照更容易解释的顺序描述车道。对照组和EZH2-缺失的HUVEC在FSS下培养3天。**e（电子）**western blotting数据的密度测定结果显示EZH2、，n个 = 3, **对 < 0.01, ***对<0.001，使用Tukey对所有平均数对进行事后比较的单向方差分析。**（f）**,克western blotting数据的密度测定结果分别显示MAPK7的总磷酸化水平（标准化为GAPDH）和磷酸化MAPK7与总表达MAPK7之比（均标准化为GA PDH），n个 = 3, **对 < 0.01, ***对<0.001，使用Tukey对所有平均数对进行事后比较的单向方差分析。小时典型的蛋白质印迹图像显示MAPK7在血流停止后迅速去磷酸化。细胞在静态条件下或FSS下培养72h；然后，在细胞溶解前，将一组在静态条件下再放置1小时（“停止FSS 1小时”）我,j个密度测定结果显示MAPK7磷酸化和EZH2蛋白表达水平分别标准化为GAPDH。“停止”标题是指1小时停止FSS条件（参见小时),n个 = 3, ***对<0.001，使用Tukey对所有平均数对进行事后比较的单向方差分析

图4
在EZH2调节的基因中显著过度表达的生物过程基因本体术语(*面板a*)或通过FSS(*面板b*). 该图显示了在EZH2缺失时，GO-BP术语的REVIGO表示在两倍或更多受调节的基因列表中丰富(一)或FSS暴露(b条). GO显著丰富的术语列表（截止q个<0.05）。气泡的大小对应于分析中属于特定GO项的基因组的大小。向上上调基因，向下下调基因。准确（已更正）对值，请比较补充表2、3、5和6

图5
EZH2和FSS调节的基因在GO术语细胞粘附和细胞周期中最为丰富。一面积比例维恩图，描述了EZH2耗竭上调的基因列表（SCR-static vs.SH-EZH2-static）和FSS暴露上调的基因（SCR-static vs.SCR-FSS）的交叉点。b条面积比例维恩图，描绘了EZH2耗竭下调的基因列表（SCR静态vs.SH-EZH2-静态）和暴露于FSS下调的基因列表（SCR静态vs.SCR-FSS）的交叉点。**c（c）**受EZH2缺失和FSS暴露上调的103个基因列表中，REVIGO衍生的GO-BP术语最显著的过度表达，以及d日REVIGO衍生出355个受EZH2缺失和FSS暴露下调的基因列表中最显著过度表达的GO-BP术语。显著丰富的GO术语(q个<0.05）源自PANTHER 9.0过度表达分析。GO浓缩q个值见补充表9和10

图6
细胞周期相关基因是一组候选基因，受FSS后EZH2减少的调节。一与BP-GO足月儿细胞周期相关的基因相对表达水平的热图表示，这些基因受EZH2耗竭和FSS暴露和b条细胞周期相关基因亚群RNA-seq结果的实时PCR验证，n个 = 3,*误差线*描述平均值的SE**对 < 0.01, ***对所有平均值对之间具有Tukey事后比较的<0.001单向方差分析

图7
细胞周期相关基因网络的下调导致内皮细胞增殖减少。一与GO期细胞周期相关的基因产物由EZH2和FSS共同调节，形成相互依赖的网络。使用String 9.1分析EZH2和FSS调节的基因列表，这些基因属于GO术语细胞周期（最显著富集组）。描述了基因产物之间相互作用的证据观点。b条免疫荧光染色检测打乱对照（SCR）和EZH-缺失（SH-EZH2）内皮细胞中Ki67蛋白表达的代表性图像(*上部面板*).下部面板图为DAPI信号，表示核染色。这个*白色条*表示100µm。**c（c）**增殖细胞的平均百分比，由所有DAPI阳性细胞中Ki67阳性细胞的百分比导出[即Ki67阳性的细胞数归一化为量化区域中的所有细胞数（DAPI）]，表明EZH2-缺失细胞的增殖能力降低。这些结果是通过使用TissueFAXS TissueQuest软件进行分析得出的，n个 = 4, ***对 < 0.001,t吨测试。d日细胞周期蛋白A、B和E的蛋白质表达的代表性蛋白质印迹结果。**e（电子）**细胞周期蛋白A、B和E蛋白表达的密度定量，归一化为GAPDH。n个 = 4, *对 < 0.05, **对<0.01，学生t吨测试，*误差线*描述平均值的SE和**（f）**MAPK13、TRNP1、TUBA4A、GEM和TXNIP相对表达的热图表示，这些细胞周期相关基因的表达因EZH2缺失和FSS暴露而增加

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参考文献

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[1] Chiu JJ，Chien S.血流紊乱对血管内皮的影响：病理生理学基础和临床前景。《生理学评论》2011；91(1):327–387. doi:10.11152/physrev.00047.2009。-内政部-项目管理委员会-公共医学

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