eIF6 coordinates insulin sensitivity and lipid metabolism by coupling translation to transcription

doi:10.1038/ncomms9261

.2015年9月18:6:8261。

doi:10.1038/ncomms9261。

eIF6通过结合翻译与转录来协调胰岛素敏感性和脂质代谢

附属公司

¹INGM，“Romeo ed Enrica Invernizzi”，2012年，意大利米兰。
²英国利物浦大学综合生物学研究所计算生物学与建模中心，利物浦L69 7ZB。
^三生物物理研究所，38123特伦托，意大利。
⁴意大利特伦托38123，特伦托大学综合生物学中心。
⁵IFOM基金会，20139年，意大利米兰。
⁶德国小鼠诊所，实验遗传学研究所，慕尼黑亥姆霍兹中心，85764 Neuherberg，德国。
⁷德国慕尼黑81377路德维希·马克西米利安大学基因中心分子动物育种和生物技术研究所。
⁸德国慕尼黑科技大学Else Kröner-Fresenius中心，邮编85354。
⁹德国慕尼黑理工大学生命与食品科学中心Weihenstephan，邮编85354。
¹⁰德国糖尿病研究中心，85764 Neuherberg，Germany。
¹¹米兰大学生物科学系，20133年，意大利米兰。

PMID： 26383020
预防性维修识别码：项目经理4595657
内政部： 10.1038/ncomms9261

eIF6通过结合翻译与转录来协调胰岛素敏感性和脂质代谢

丹妮拉·布利纳等。国家公社. 2015.

.2015年9月18:6:8261。

doi:10.1038/ncomms9261。

附属公司

¹INGM，“Romeo ed Enrica Invernizzi”，意大利米兰，20122年。
²英国利物浦大学综合生物学研究所计算生物学与建模中心，利物浦L69 7ZB。
^三意大利特伦托38123生物物理研究所。
⁴意大利特伦托38123，特伦托大学综合生物学中心。
⁵IFOM基金会，20139年，意大利米兰。
⁶德国实验遗传学研究所德国老鼠诊所，德国慕尼黑亥姆霍兹中心，85764 Neuherberg。
⁷德国慕尼黑81377路德维希·马克西米利安大学基因中心分子动物育种和生物技术研究所。
⁸德国慕尼黑科技大学Else Kröner-Fresenius中心，邮编85354。
⁹德国慕尼黑理工大学生命与食品科学中心Weihenstephan，邮编85354。
¹⁰德国糖尿病研究中心，85764 Neuherberg，Germany。
¹¹米兰大学生物科学系，20133年，意大利米兰。

PMID： 26383020
预防性维修识别码：项目经理4595657
内政部： 10.1038/ncomms9261

摘要

胰岛素调节血糖、脂肪生成并增加mRNA翻译。具有减少的真核起始因子6（eIF6）的细胞不会增加对胰岛素的翻译。胰岛素调节翻译的作用尚不清楚。在这里，我们发现eIF6杂合子小鼠中胰岛素调节翻译的减少导致血糖正常，但血液胆固醇和甘油三酯减少。eIF6以细胞自主方式控制脂肪酸合成和糖酵解。eIF6通过对脂肪生成转录因子如C/EBPβ、C/EBPδ和ATF4的翻译控制起作用，这些转录因子在其5'UTR中具有富含G/C或uORF序列。eIF6翻译激活的结果是通过增加脂肪生成酶和糖酵解酶水平来重塑基因表达。最后，eIF6水平调节组蛋白乙酰化和速率限制性脂肪酸合成酶（Fasn）mRNA的数量。由于肥胖、2型糖尿病和癌症需要Fasn驱动的脂肪生成状态，我们认为eIF6可能是这些疾病的治疗靶点。

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数字

**图1。eIF6缺乏会损害喂食后肝脏中多聚体的形成，降低血脂，防止HFD和肝脏脂肪变性。**
所有图形，黑色，wt；红色，eIF6 het小鼠(一)wt（黑色）和eIF6 het（红色，+/-）的代表性肝脏多糖体谱显示，隔夜禁食后het中的多糖体减少，4 h重新进料。实验重复至少五次。(b条)与重量相比，eIF6 het（红色）的GTT正常。N个=7. (**c（c）**,d日)与wt组相比，eIF6 het组血液中的胆固醇和甘油三酯水平降低(N个=10). (**e（电子）**)eIF6 het小鼠肝脏甘油三酯含量降低(N个=4). (**（f）**)eIF6 het中ATP肝含量降低。N个=3. (克)eIF6 het小鼠受到HFD的保护：与体重相比，eIF6 het小鼠的体重增加减少。N个=10.顶栏显示绝对体重增加。下图，体重。(小时)GTT eIF6 het小鼠在2 葡萄糖注射后h。N个=10. (我)ITT（AUC ITT，曲线下面积）显示饮食诱导的胰岛素抵抗部分改善。N个=5 (j个,k个). 肝脏X射线衰减增加(N个=8）表明肝脏中脂肪沉积减少(j个)通过单独动物的尸检肝脏甘油三酯含量证实(N个=5) (k个). (我)在人类中，eIF6水平与HOMA-IR测量的胰岛素敏感性呈负相关。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差。统计*P（P）*值通过双尾计算t吨-测试(**P（P）*值≤0.05）。

**图2。eIF6活性细胞自主控制脂肪酸合成、糖酵解和ATP水平。**
(一)分析概要。按照规定分离和分析小鼠的原代肝细胞。对生物复制品进行的实验。所有数据均以对照组的百分比（wt）表示，分析同窝出生的小鼠对的原代细胞。(b条)*从头开始*脂肪生成，通过标记测量D类-[6-¹⁴C] -eIF6 het小鼠细胞中的葡萄糖和随后的脂肪酸分析减少。细胞保存在100个 nM胰岛素和20 mM葡萄糖。N个=6 (**c（c）**)eIF6 het小鼠肝细胞中的乳酸分泌（糖酵解通量的指标）减少。基本值约为30 下午微克⁻¹蛋白质/小时。N个=6. (d日)脂肪酸氧化未受到显著影响（对照的基础值约为1000 下午约。微克⁻¹蛋白质）。N个=4 (**e（电子）**–克)ATP内容取决于eIF6级别：(**e（电子）**)eIF6 het小鼠与wt小鼠相比，ATP降低。(**（f）**)eIF6的急性耗竭导致eIF6中ATP水平的降低^+/+细胞，而(克)eIF6水平的恢复导致eIF6中ATP的增加^+/−细胞。(小时)乳酸分泌，如(**（f）**)AML12细胞中eIF6 shRNA之后。(我)ATP（如中所示）(d日)在AML12细胞中eIF6 shRNA之后。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差*P（P）*值通过双尾计算t吨-测试(**P（P）*值≤0.05****P（P）*≤0.001). (**e（电子）**–我),N个=3.

**图3。eIF6翻译活性控制脂肪生成转录因子的表达。**
(一)如多聚体/80S比率所示，eIF6抑制和胰岛素给药的整体启动减少。数据表示为平均值±标准差。统计*P（P）*数值通过双尾法计算t吨-测试(n个=4. ****P（P）*值≤0.001）。(b条)分析和定量结果概述：eIF6 shRNA多聚体中的一个子集信使核糖核酸被不同地耗尽（绿色）。通过分位数方法获得归一化比率。考虑到多胞体面积减少的校正表明，更多基因受到eIF6缺乏的影响。(**c（c）**)基因本体分析表明，从标准化比率库来看，eIF6受影响的基因中代谢占主导地位(*P（P）*值≤10⁻¹²). (d日)eIF6缺乏症影响基因的结构5′-UTR分析。eIF6缺失细胞的多聚体显示富含G/C的5′mRNA减少（绿色框）(**e（电子）**)eIF6 shRNA上的多聚体中缺乏与脂肪生成有关的转录因子。包括其5′UTR的结构特征。(**（f）**)C/EBPδ蛋白表达受eIF6调节。通过慢病毒给药，eIF6增加诱导C/EBPδ。慢病毒介导的shRNA导致eIF6缺失，从而降低C/EBPδ。对AML12肝细胞和重组间充质干细胞进行三次代表性实验(克)在eIF6缺失的细胞中，成脂转录因子C/EBPβ（LIP亚型）减少。左侧，C/EBPβ的mRNA结构通过差异翻译生成三种亚型（箭头：翻译起始位点）。带有蓝色箭头的蓝色小方框是C/EBP uORF。右面板显示LAP、LIP和C/EBPβ亚型的斑点：LIP亚型特异性下调。（代表性实验一式三份）。(小时)ATF4报告器翻译依赖于eIF6。利用天然ATF4 uORF下游克隆的荧光素酶（蓝盒）进行再激活的报告人试验。eIF6上调会增加ATF4翻译报告活性，eIF6下调会降低ATF4的翻译报告活性。数据会根据cap-dependent firefly控件的翻译进行标准化。黑色大箭头表示第二个uORF的终止密码子。小箭头是起始密码。蓝盒子是记者。统计学*P（P）*值通过双尾计算t吨-测试，如上所述(**P（P）*值≤0.05***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001).

**图4。eIF6缺失在胰岛素应答组织中诱导一个特定的转录信号。**
(一)成人肝脏的微阵列分析显示eIF6 het小鼠的基因表达发生了广泛的重塑。eIF6 het肝脏中的协同转录变化在稳态水平上确定了一种深刻的代谢重编程，与脂质生物合成的减少一致，并对染色质重塑和细胞周期产生额外影响。(b条)多器官微阵列分析。肝脏、脂肪和大脑的热图分析显示，脂肪和肝脏中的脂质生物合成过程受到抑制，但大脑中没有。该量表表示通过使用修正的Fisher精确检验（EASE评分）获得的基因本体论术语的富集的统计显著性。这会产生一个*P（P）*值，然后使用FDR（Benjamini）针对多次测试进行校正。1.3=*P（P）*值≤0.05，2=*P（P）*值≤0.01，3=*P（P）*值≤0.001，5=*P（P）*值≤0.00001(**c（c）**)脂肪酸合成、糖酵解和胆固醇合成途径中受eIF6水平影响的基因概述。所有蓝色标记的基因在转录水平上下调。(d日)对选定靶点的实时分析验证了所有靶基因（肝组织）。这里，我们展示了在不同动物群上进行的具有代表性的生物三重实验，（五个用于eIF6和Fasn，两个用于其他动物）（数据显示为n个=3; 平均值±标准差）。(**e（电子）**)在蛋白质水平上也发现了一致的变化。Hmgcr、Fasn（在mRNA水平下调）和Pgc-1α（在mRNA水平上调）的代表性印迹，一式三份。另请参见补充图4。(n个=3).

**图5。Fasn水平由eIF6活性控制。**
(一)肝细胞和原代干细胞的抢救策略。用eIF6 shRNA或wt eIF6转导细胞，检查eIF6蛋白水平并分析Fasn mRNA和蛋白。(b条)AML12肝细胞中诱导shRNA下调eIF6导致Fasn mRNA减少(**c（c）**–d日)eIF6对分化为脂肪细胞的间充质干细胞中Fasn mRNA水平有直接影响。wt或het干细胞要么用组成性eIF6 shRNA转导(**c（c）**)或wt eIF6(d日)并检测Fasn的表达。观察到eIF6水平和Fasn水平之间存在直接相关性。(**e（电子）**)Fasn蛋白由AML12和EMSC脂肪细胞中的eIF6水平控制。EMSC实验显示wt细胞中eIF6下调或het细胞上调。注意Fasn和LIP亚型的eIF6依赖水平。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差面板**e（电子）**显示了两个独立的eIF6 shRNA的作用，构成（右）或诱导。统计学*P（P）*值通过双尾计算t吨-测试(**P（P）*值≤0.05***P（P）*≤0.01时****P（P）*≤0.001). 对至少两个独立实验的生物三倍体进行实时实验和蛋白质印迹。实时显示一份一式三份。

**图6。eIF6靶向导致Fasn减少和组蛋白乙酰化。**
(一)通过连接图的策略：识别和测试产生类似eIF6特征的药物。(b条)连接图确定了两种翻译抑制剂，嘌呤霉素和环吡酮，以及两种HDAC抑制剂，TSA和MS-275。(**c（c）**–d日)HDAC抑制剂下调Fasn；HDAC抑制剂TSA（而非MS-275）降低eIF6 mRNA(**c（c）**)但两种HDAC抑制剂均下调Fasn mRNA(d日). (**e（电子）**)与基因本体分析（图4a）和连接图一致，eIF6缺失增加了H3K9乙酰化。对指定年龄段的肝脏或AML12细胞进行Western blot分析。显示了具有代表性的密度测定斑点。(**（f）**)通过抑制eIF6激活的策略：测试eIF6 S235A的突变。S235A突变体在胰岛素刺激后无法恢复翻译。(克–小时)在EMSC细胞中重新引入eIF6可诱导Fasn。(克)实时分析恢复的wt和突变eIF6水平。(小时)在相同细胞中分析Fasn mRNA。wt eIF6而非eIF6 S235A突变，恢复Fasn的mRNA水平。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差*P（P）*值通过双尾计算t吨-测试(n个=3). 至少重复两次***P（P）*值≤0.01****P（P）*≤0.001 (我)基于图1、2、3、4、5、6数据的模型。胰岛素诱导翻译。eIF6有助于翻译编码成脂转录因子的uORF和富含G/C的mRNA。最终结果是激活了脂质生物合成途径。eIF6抑制剂阻断脂肪生成并逆转胰岛素抵抗。

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1. Clark J.M.成人非酒精性脂肪肝的流行病学。临床杂志。胃肠病学。40，S5-10（2006年）。-公共医学
1. Marchesini G.等人，非酒精性脂肪肝与胰岛素抵抗的相关性。《美国医学杂志》第107卷，第450–455页（1999年）。-公共医学
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[3] Clark J.M.成人非酒精性脂肪肝的流行病学。临床杂志。胃肠病学。40，S5-10（2006年）。-公共医学

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