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.2015年8月28日；10（8）：e0136502。
doi:10.1371/journal.pone.0136502。 电子收集2015。

肝常驻细胞TLR4表达介导实验性牙周炎糖耐量异常和胰岛素抵抗的发生

弗拉基米尔·伊里夫斯基 1, 耶鲁·赵 2, 普里亚·卡瓦拉 三, 赫里伯托·罗德里格斯 三, 玛格丽特·托维耶卡 三, 大卫·库里安 三, 拉拉·利奥尼 4, 约翰·W·克里斯曼 5, 特里·甘特曼 6, 渡边惠子 1
附属公司

肝常驻细胞TLR4表达介导实验性牙周炎糖耐量异常和胰岛素抵抗的发生

弗拉基米尔·伊里夫斯基等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：流行病学研究结果表明牙周炎与2型糖尿病之间存在密切关系。然而，牙周炎与葡萄糖不耐受（GI）和胰岛素抵抗（IR）之间的联系机制尚不清楚。因此，我们验证了牙周炎通过肝脏Toll样受体4（TLR4）依赖性机制诱导GI/IR发展的假设。

方法：以表达绿色荧光蛋白的TLR4WT小鼠（GFPWT）为供体，TLR4 WT或TLR4-/-为受体小鼠（分别为GFPWT:WT和GFPWT:KO嵌合体），通过骨髓移植制备TLR4嵌合体小鼠。对这些嵌合体进行为期18周的实验性慢性牙周炎，该牙周炎是由牙龈沟反复施用脂多糖引起的。在糖耐量差异最明显的18周时监测GI/IR水平，并测定血浆细胞因子和LPS。qPCR检测肝组织中细胞因子基因的表达。

结果：与PBS或GFPWT:KO嵌合体治疗的嵌合体相比，LPS治疗的GFPWT:WT嵌合体的牙槽骨丢失明显更大。然而，使用LPS的GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠的牙龈炎症程度相似。GFPWT:WT嵌合体发生严重GI/IR，但GFPWT:KO嵌合体在接受18周LPS治疗后未发生GI/IR。仅在应用LPS的动物中检测到血清LPS，并且在18周时GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠中的水平相似。令人惊讶的是，尽管使用LPS的GFPWT:WT嵌合体存在严重的GI/IR，但18周时血浆IL1β、IL6和TNFα水平没有显著差异。此外，在GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠的肝脏中，TNFα或IL6 mRNA的表达没有差异。相反，与LPS处理的GFPWT:KO嵌合体相比，GFPWT:WT嵌合体中肝脏IL1β的表达显著增加。

结论：我们观察到，尽管牙龈炎症程度、循环细胞因子水平和LPS浓度相似，但经LPS治疗的GFPWT:WT嵌合体（而非GFPWT:KO嵌合体）仍能形成GI/IR。我们得出结论，牙周炎部位的脂多糖通过一种涉及肝脏中常驻巨噬细胞/Kupffer细胞TLR4表达的机制，在触发GI/IR的发展中起着关键作用。

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图1
图1。牙龈沟应用LPS后，牙周炎LPS对肝脏的假设影响以及对葡萄糖耐量的影响。
途径代表LPS应用于牙龈沟后，GFPWT:WT（A）和GFP-WT:KO嵌合体（B）在牙周和肝脏中的拟议活性。（A） 革兰氏阴性菌的脂多糖在牙龈沟中释放，起化学引诱剂的作用。循环血液中的巨噬细胞（TLR4+/+）迁移到牙龈组织，在那里被LPS激活，并分泌促炎细胞因子，如TNFα、IL1β和IL6。这些细胞因子和/或LPS进入循环并最终到达肝脏。位于窦状体内的肝脏枯否细胞会暴露于LPS和/或促炎细胞因子。在GFPWT:WT动物中，库普弗细胞是TLR4+/+，并将通过合成和分泌促炎细胞因子对LPS作出反应，导致ipGTT受损。此外，循环中的细胞因子可损害肝细胞中的胰岛素信号通路。（B） 在GFPWT:KO动物中，枯否细胞是TLR4-/-，如果肝脏枯否细胞的主要刺激物是脂多糖，这些动物的ipGTT将是正常的。然而，循环促炎细胞因子可能直接作用于肝细胞，导致ipGTT受损。IR：胰岛素抵抗，ipGTT：腹腔葡萄糖耐量试验。
图2
图2。嵌合小鼠实验时间表和生成的示意图。
（A） 时间轴，（B）嵌合小鼠的产生：从供体小鼠（GFPWT）分离骨髓衍生细胞（BMDC）并移植到受照小鼠（WT或TLR4-/-）。服用抗生素（AB）5周后，抽取外周血，进行FACS分析，确认>90%的循环血细胞表达GFP。
图3
图3。通过免疫荧光显微镜和qPCR进一步确认嵌合体的生成。
供体巨噬细胞迁移到GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠的牙龈中，而Kupffer细胞保留其受体表型。（A） 应用LPS后，免疫荧光显微镜检测GFPWT:WT（顶面板）和GFPWT:KO（底面板）嵌合体中靠近牙齿的牙龈组织中TLR4+巨噬细胞（ED1+）。应用LPS后，GFPWT:WT和GFPWT:KO嵌合体中的牙龈巨噬细胞表达TLR4+、GFP+和ED1+。红色：TLR4+，绿色：GFP+，蓝色：ED1+。箭头表示迁移的供体巨噬细胞。（B） 免疫荧光显微镜鉴定LPS应用后GFPWT:WT嵌合体中维持受体表型的肝脏Kupffer细胞（顶面板，箭头：TLR4+、GFP-、ED1+细胞）。GFPWT:KO中的枯否细胞为TLR4-、GFP-、ED1+（底部面板，箭头：TLR4-，GFP-，ED1+细胞）。少数GFP+、TLR4+、ED1+细胞可能迁移供体巨噬细胞，取代受体Kupffer细胞。红色：TLR4+，绿色：GFP+，蓝色：ED1+。（C） 肝脏TLR4（a）和F4/80（b）表达的实时PCR分析。采用TaqMan Real-Time PCR分析TLR4和巨噬细胞标记物F4/80在肝脏的表达。与GFPWT:KO小鼠相比，GFPWT:WT小鼠中TLR4的表达显著升高（a）。GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠F4/80表达无统计学差异。x轴：嵌合组，y轴：TLR4（a）和F4/80（b）的相对表达。全部归一化为β-肌动蛋白。n=8-12/嵌合组（4-6/治疗组）。给出的数据为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.001。
图4
图4。在使用LPS和PBS的动物中测定血清LPS浓度。
LPS仅存在于接受LPS治疗的动物的血浆中。x轴：嵌合组，y轴：LPS浓度（EU/ml）。给出的数据为平均值±标准偏差。n=8-12/嵌合组（4-6/治疗组）。所提供的数据为平均值±标准差。*p<0.001
图5
图5。LPS应用于牙龈沟导致牙龈炎症和骨质流失。
牙龈应用LPS（A-F）后，两种嵌合体均出现牙龈炎症。牙龈炎症程度通过炎症浸润的数量（A）和IL1β（B）、TNFα（C）、IL6（D）、MCP1（E）和MMP9（F）产生细胞的鉴定来确定。使用H&E染色切片定量测量炎症浸润（每个治疗组4个）（A）。通过免疫荧光显微镜评估表达细胞因子（B、C、D）、MCP1（E）和MMP9（F）的细胞数量（每个治疗组4个）。经LPS（A）治疗的GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠均出现炎症浸润。插图显示炎症细胞浸润。箭头指向炎症细胞。在两个嵌合组中，LPS治疗动物的炎性细胞数量显著高于PBS治疗动物（p<0.01）（A）。应用LPS的嵌合体之间的浸润量没有统计学差异（A）。在应用LPS的GFPWT:WT和GFPWT:KO小鼠中，IL1β、TNFα、IL6、MCP1和MMP9（B-F）染色的细胞数量也没有统计学差异。箭头表示GFP+供体细胞分别表达IL1β（B）、TNFa（C）、IL6（D）、MCP1（E）和MMP9（F）。在放大400倍的光学显微镜下观察的5个随机区域中，对炎症细胞浸润进行计数。在放大200倍的条件下拍摄H&E切片的照片。插图为400X（A）。细胞因子、MCP1和MMP9阳性细胞在5个随机区域计数，并在400倍放大的免疫荧光显微镜下观察。在400X（B-F）下拍摄免疫荧光显微镜照片。在所有情况下，检查人员都对组织切片所属的动物组一无所知。x轴：嵌合组。y轴：单元格数/随机字段。所提供的数据为平均值±标准偏差。（G）在LPS或PBS治疗18周后，通过显微断层扫描（GFPWT上颌显微断层扫描：WT嵌合体）评估牙槽骨丢失。牙骨质-牙釉质结合部（CEJ）和牙槽嵴之间的距离以红色显示。GFPWT:WT嵌合体中显示的CEJ和牙槽骨之间的距离（未使用LPS）由附着在牙根上的连接上皮和结缔组织占据，因此不能反映实际骨丢失（G-a）。嵌合体组骨丢失的比较（G-b）：右下角的括号表示上皮和结缔组织附着的平均距离。顶部的括号表示平均骨质流失。与PBS治疗组相比，患有LPS的GFPWT:WT小鼠的骨丢失在统计学上更大。在GFPWT:KO动物（G-b）中，PBS和LPS治疗组之间的骨丢失没有统计学上的显著差异。x轴：嵌合体组，y轴：第二上颌磨牙腭中部从CEJ到牙槽骨嵴的距离（mm）。n=每个嵌合组8-12个（每个治疗组4-6个）。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.05。
图6
图6。18周以上的葡萄糖耐量测试结果。
18岁时出现严重葡萄糖不耐受第个GFPWT:患有牙周炎的野生型动物。在第0周（基线）、第5周、第10周、第14周和第18周对GFPWT:WT（上面板）和GFPWT:KO嵌合体（下面板）进行ipGTT，并应用LPS或PBS。这些嵌合体在基线检查时的ipGTT结果没有差异（数据未显示）。每个时间点的数据均为平均值±标准偏差。x轴：葡萄糖注射后min，y轴：葡萄糖水平（mg/dL）。n=8-12/嵌合组（4-6/治疗组）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7
图7。在18周内测量空腹血糖、胰岛素和HOMA-IR。
在基线检查时以及第5、10、14和18周测量空腹血糖（A）、胰岛素（B）和HOMA-IR（C）。18周时，GFPWT:WT组LPS动物的IR和空腹胰岛素水平显著高于PBS组。x轴：嵌合群；GFPWT:WT，GFPWTKO，C：对照（PBS应用），P：牙周炎（LPS应用）。y轴：空腹血糖浓度（mg/dL）（A）、空腹胰岛素浓度（μg/L）（B）和HOMA-IR指数（C）。给出的数据为平均值±标准偏差。n=8-12/嵌合体组（4-6/治疗组）。*p<0.05。
图8
图8。ELISA法测定血浆细胞因子水平。
用Q-Plex ELISA测定已知引起IR的IL1β、TNFα和IL6的血浆水平。x轴：嵌合组。y轴：浓度（pg/ml）。18周时的数据为平均值±SD。使用LPS或PBS的各组之间没有统计差异（p>0.05），n=8-12/嵌合组（4-6/治疗组）。
图9
图9。qPCR检测肝脏IL1β和TNFα的表达。
（A） 与PBS处理的动物和LPS和PBS处理组中的GFPWT:KO小鼠相比，用LPS处理的GFPWT:WT小鼠中的IL1β水平显著更高。在GFPWT:KO动物中，用LPS或PBS处理的动物IL1β没有显著增加。（B） 应用LPS和不应用LPS的嵌合体之间的TNFα表达没有显著差异。肝脏中未检测到IL-6（数据未显示）。x轴：嵌合组，y轴：相对基因表达水平。所提供的数据为平均值±标准差。每个嵌合组n=8-12（每个治疗组4-6）*p<0.05。
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参考文献

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MeSH术语