Human Engineered Heart Muscles Engraft and Survive Long Term in a Rodent Myocardial Infarction Model

doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306985

.2015年9月25日；117(8):720-30.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306985。 Epub 2015年8月19日。

人类工程心肌植入在鼠心肌梗死模型中的长期存活

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¹来自斯坦福大学心血管研究所医学部心脏病学系（J.R.、A.E.、E.T.、U.R.、O.J.A.、O.S.、N.G.K.、E.N.、M.W.、P.S.T.、J.D.G.、J.C.W.）和加利福尼亚州斯坦福大学医学院病理学系（A.J.C.）；加利福尼亚州帕洛阿尔托医疗系统退伍军人管理局研发部（P.S.T.）；药理学研究所、心脏研究中心、大学医学中心、乔治亚大学和德国哥廷根心血管研究中心（M.T.、T.M.、W.H.Z.）；以及加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所生物医药和遗传学中心（V.C.C.，L.A.C.）和应用技术开发中心（A.J.C.）。
²来自斯坦福心血管研究所医学系心脏病学系（J.R.、A.E.、E.T.、U.R.、O.J.A.、O.S.、N.G.K.、E.N.、M.W.、P.S.T.、J.D.G.、J.C.W.）和加利福尼亚州斯坦福大学医学院病理学系（A.J.C.）；加利福尼亚州帕洛阿尔托医疗系统退伍军人管理局研发部（P.S.T.）；药理学研究所、心脏研究中心、大学医学中心、乔治亚大学和德国哥廷根心血管研究中心（M.T.、T.M.、W.H.Z.）；以及加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所生物医药和遗传学中心（V.C.C.，L.A.C.）和应用技术开发中心（A.J.C.）。joewu@stanford.edu w.zimmermann@med.uni-goettingen.de。

PMID： 26291556
PMCID公司：项目经理4679370
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.115.306985

人类工程心肌植入在鼠心肌梗死模型中的长期存活

约翰内斯·里格勒等。循环研究. 2015.

.2015年9月25日；117(8):720-30.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306985。 Epub 2015年8月19日。

附属公司

¹来自斯坦福大学心血管研究所医学部心脏病学系（J.R.、A.E.、E.T.、U.R.、O.J.A.、O.S.、N.G.K.、E.N.、M.W.、P.S.T.、J.D.G.、J.C.W.）和加利福尼亚州斯坦福大学医学院病理学系（A.J.C.）；加利福尼亚州帕洛阿尔托医疗系统退伍军人管理局研发部（P.S.T.）；药理学研究所、心脏研究中心、大学医学中心、乔治亚大学和德国哥廷根心血管研究中心（M.T.、T.M.、W.H.Z.）；以及加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所生物医药和遗传学中心（V.C.C.，L.A.C.）和应用技术开发中心（A.J.C.）。
²来自斯坦福大学心血管研究所医学部心脏病学系（J.R.、A.E.、E.T.、U.R.、O.J.A.、O.S.、N.G.K.、E.N.、M.W.、P.S.T.、J.D.G.、J.C.W.）和加利福尼亚州斯坦福大学医学院病理学系（A.J.C.）；加利福尼亚州帕洛阿尔托退伍军人管理局医疗保健系统研发部（P.S.T.）；药理学研究所、心脏研究中心、大学医学中心、乔治亚大学和德国哥廷根心血管研究中心（M.T.、T.M.、W.H.Z.）；以及加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所生物医药和遗传学中心（V.C.C.，L.A.C.）和应用技术开发中心（A.J.C.）。joewu@stanford.edu w.zimmermann@med.uni-goettingen.de。

PMID： 26291556
PMCID公司：项目经理4679370
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.115.306985

摘要

理论基础：组织工程方法可以提高人类胚胎干细胞源性心肌细胞移植的存活率和功能益处，从而潜在地防止扩张性重塑和进展为心力衰竭。

目标：评估慢性心肌梗死模型中工程化心肌（EHM）的运输稳定性、长期存活率、结构组织、功能益处和畸胎瘤风险。

方法和结果：我们从人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞中构建了EHM，并根据预先确定的质量控制标准将其释放用于跨大西洋运输。两天的运输不会对EHM的细胞活力或收缩性能产生不利影响（n=3，P=0.83，P=0.87）。缺血/再灌注损伤后一个月，将EHM植入免疫功能受损的大鼠心脏，模拟慢性缺血。生物发光成像显示植入稳定，在第2周至第12周之间无明显细胞丢失（n=6，P=0.67），保留≤25%的移植细胞。尽管植入率高且疾病进展减缓（EHM射血分数变化为-6.7±1.4%，与对照组相比为-10.9±1.5%；n>12；P=0.05），但在该慢性异种移植模型中，我们观察到含有存活和不存活人类心肌细胞的EHM之间没有差异（n>12，P=0.41）。移植后220天，移植心肌细胞的肌节排列增强，连接蛋白43表达增加。在用于长期监测的所有动物（n=14）中均未发现畸胎瘤或肿瘤。

结论：EHM移植导致人类心肌细胞的高植入率、长期存活率和逐渐成熟。然而，在这种慢性心肌梗死模型中，细胞移植与功能改善无关。最重要的是，这种方法的安全性被证明是没有肿瘤或畸胎瘤形成。

关键词：心脏MRI；心功能测试；细胞存活；心肌梗死；心肌缺血；组织工程；移植。

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数字

**图1。人类工程心肌（EHM）在装运两天后显示出心肌细胞排列、生存能力和力量生成的稳健性**
（A、B）单独担架上用于机械成熟的EHM照片和力测试前的平板上的EHM图片。（C） EHM的荧光显微镜图像，显示心肌细胞（α-肌动蛋白，α-act）在其横截面上的分布，沿着外边界的浓度略高。（D）装运两天后，细胞存活率（n=3，P=0.83）、心肌细胞含量（n=3，P=0.86）或主动力生成（n=3,P=0.87）均无变化。（E）心肌细胞（人心肌肌钙蛋白T，cTnT）的类心脏组织组织在EHM的某些区域，特别是靠近外部边界的区域。（F）大多数EHM横截面显示心肌细胞（β肌球蛋白重链，MyHc）沿主应变轴呈带状排列，连接蛋白43（Con43）表达水平较低。（G）从EHM环中心250μm厚成像体的最大强度投影进一步说明了带状细胞的排列。比例尺B:5 mm；C： 1毫米；E、 F:50μm；G： 100微米。

**图2。人类EHM表现出长期植入和存活**
（A）单个EHM回路的代表性生物发光图像体外（左）和植入后85天（右）。（B，C）EHM在第14天到第85天之间的生存能力没有显著下降（n=6，P=0.33）。（D）将EHM植入免疫活性大鼠心脏（Sprague-Dawley，SD）后7天内几乎完全失去信号（红色虚线，n=2）。然而，当他克莫司每日两次（7.5 mg/kg/天）给药时，BLI信号与裸鼠中的信号相当，表明实现了有效的免疫抑制。（E） SD大鼠的有效免疫抑制使移植物存活率与裸鼠相当（SD+Tac n=5 vs.裸鼠n=6；P=0.88）。平均辐射度表示为10⁶光子/秒/cm²/斯特拉迪安。

**图3。植入EHM一个月后可以找到大小合适的人心肌细胞移植物**
（A–D）植入EHM一个月后，在H&E或Masson三色（M–T）切片上发现移植物覆盖瘢痕区或边缘区。EHM通常通过一小层纤维化组织与宿主分离。（E）在所有评估的EHM心脏中，均可发现人类β-整合素1（β-Integ）染色阳性的移植物。通过生长到移植物中的宿主血管（CD31）灌注移植物（30μm截面的最大强度投影）。（F）移植物主要由β肌球蛋白重链（MyHc）染色阳性的人类CMs组成，但很少有细胞连接蛋白43（Con43）染色阳性。（G）虽然可以发现明显条纹状的肌节（心肌肌钙蛋白T，cTnT；α-肌动蛋白，α-act），但肌原纤维排列的迹象很少。（H） EHM显示少量浸润巨噬细胞（CD68），表明移植物稳定。比例尺A、C：5 mm；B、 D:1毫米；E、高度：100μm；F、 G:50μm。

**图4。EHM植入可减少扩张性重塑，但这种效应并非由于人类CM植入所致**
（A–C）顶行显示EHM植入或假手术前一天和28天舒张末期（ED）具有代表性的2腔长轴视图（对照组）。中间一行显示的是收缩末期（ES）相同的心脏，而底部一行显示了相应的心室中水平晚期钆增强图像（LGE）。（D，E）所有组的舒张末期容积均增加，但无显著差异（P=0.35）。所有组的收缩末期容积也增加，但与所有其他组相比，对照组的收缩末容积最为显著（对照组n=12，EHM n=14；P=0.05）。（F，G）各组射血分数均下降。与EHM植入组相比，对照组的相对下降幅度最大（P=0.03）；然而，EHM和不含活性CM的辐照EHM之间没有差异（P=0.19），这表明移植细胞可能不会直接介导对重塑的有益影响。（H，I，J）瘢痕大小随时间变化无显著差异（P=0.32）。（K）接受辐射EHM环的心脏的舒张功能障碍有增加的趋势（E′/a′<1），而其他组的舒张功能障碍略有下降；然而，这并没有达到统计学意义（P=0.12）。比例尺A–C：5 mm。

**图5。长期移植显示高血管密度、进行性心肌细胞排列和连接蛋白43表达**
（A，E）植入后110天和220天，在人类移植物（人类β1整合素，β-整合素）中发现高血管密度（CD31，30μm切片的最大强度投影）。（B，F）连接蛋白（connexion 43，Con43）在110天龄的移植物（B）中可以检测到表达，但植入220天的移植物表现出更成熟的表达模式，连接蛋白定位于细胞界面（F）。在人类CM中，肌角蛋白的排列也随着时间的推移而增加（β-肌球蛋白重链，β-MyHc）。（C–D）长期植入导致肌节排列更好，更成熟的肌节（α-肌动蛋白，α-act；心肌肌钙蛋白T，cTnT）跨越整个肌节宽度。（D，H）在植入110或220天后，只有少量人类细胞显示出活性细胞周期（Ki67）的迹象。（一）有趣的是，220天龄的移植物含有小病灶，其中CMs表现出富含糖原的错构瘤样表型（H&E）。（J，K）这些错构瘤样细胞来源于人类（人类核抗原，hNA），平滑肌肌动蛋白（SMA）和心脏标记物（α-act，cTnT）染色阳性，一些细胞显示有组织的肉节。（五十）无一个错构瘤样心肌细胞处于细胞周期的活跃状态（Ki67，阴性）。比例尺A、E、I：100μm；B–D、F–H、J–L:50μm。

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